$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Aktivierung der Assay-Kit-Platte
- Aktivieren Sie die Platte des 96-Well-Filters (mit blauem CPH-Xylan) (Materialliste), indem Sie 200 μl Aktivierungslösung (mit dem Kit erhalten) in jede Vertiefung geben, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur ohne Rühren.
- Wenden Sie ein Vakuum mit einem Vakuumverteiler an (mit dem Abstandsblock im Inneren und einer beliebigen standardmäßigen, transparenten 96-Well-Platte als Auffangplatte), um die vorhandene Aktivierungslösung zu entfernen. Es ist auch möglich, anstelle des Vakuumverteilers eine Zentrifuge mit 2.700 x g für 10 min für diesen Schritt zu verwenden.
- Waschen Sie die CPH-Substrate mit 100 μl sterilem Wasser und wenden Sie ein Vakuum (oder eine Zentrifugalkraft) an, um den Stabilisator zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei Mal und die Platten sind nun einsatzbereit.
2. Enzymreaktion
HINWEIS: Nehmen Sie immer Puffer allein als Negativkontrolle auf und wenn möglich zuvor charakterisierte Enzyme als Positivkontrollen. Verwenden Sie eine statistisch angemessene Anzahl von Replikaten. Die CPH-Substrate sind zwischen pH 3,0 und 10,0 stabil und das Gesamtvolumen der Pufferendenzymlösung in jeder Vertiefung sollte 180 μl nicht überschreiten. Anstelle der gereinigten Enzymlösung kann auch Pflanzenextrakt oder Kulturbrühe verwendet werden.
- Geben Sie 150 μl 100 mM Natriumacetatpuffer mit einem pH-Wert von 4,5 und 5 μl Endocellulaselösung (bis zu einer Endkonzentration von 1 μl) in jede Vertiefung der Platte des Assay-Kits.
- Legen Sie die Produktplatte (eine Klarsichtplatte, die mit dem Mikrotiterplatten-Reader kompatibel ist) unter die Platte des Assay-Kits, um mögliche Leckagen aus der Reaktionsplatte während des Schüttelns aufzufangen.
- Die Platte des Assay-Kits wird 30 Minuten lang bei 25 °C in einem horizontalen Schüttler bei 150 U/min inkubiert.
HINWEIS: Das Mischen der Reaktion in der Platte des Assay-Kits während der Inkubation ist entscheidend, um ein konsistentes und reproduzierbares Ergebnis zu erzielen. CPH-Substrate sind bis zu 90 °C stabil. Die Inkubationszeit sollte auf bis zu 24 Stunden erhöht werden, wenn Kulturbrühen, die unbekannte Enzymkonzentrationen enthalten, mit CPH-Substraten getestet werden. Beachten Sie, dass geeignete Inkubationszeiten von der Aktivität des Enzyms/der Enzyme abhängen, aber im Allgemeinen ist es wahrscheinlich, dass das Enzym das getestete Substrat nicht abbaut, wenn innerhalb von 24 Stunden keine nachweisbare Aktivität auftritt. Ein aktives Enzym baut die unlöslichen chromogenen Polysaccharide des CPH-Substrats zu löslichen chromogenen Oligosacchariden ab, die als farbiger Überstand sichtbar sind.
- Setzen Sie die Platte für das saubere Produkt mit dem Distanzblock in den Vakuumverteiler ein.
- Legen Sie die Platte des Assay-Kits darauf und legen Sie ein Vakuum an (maximaler Unterdruck von -60 kPa). Es ist auch möglich, eine Zentrifuge mit 2.700 x g für 10 min.
HINWEIS: Das Filtrat, das die farbigen Oligosaccharide als Reaktionsprodukt enthält, befindet sich nun zur weiteren Analyse in der Produktplatte.
3. Nachweis und Quantifizierung
- Überprüfen Sie durch Sichtprüfung, ob das Flüssigkeitsvolumen in jeder Vertiefung der Produktplatte ungefähr gleich ist.
- Lesen Sie die Absorption der Sammelplatte bei 595 nm für blaues CPH-Xylan mit einem Plattenlesegerät ab.
- Subtrahieren Sie bei der Datenanalyse die negativen Kontrollwerte nur für den Puffer von den Werten aus den Vertiefungen, in denen ein Enzym hinzugefügt wurde. Berechnen Sie den Mittelwert und den Standardmittelwert (REM) aus den replizierten Vertiefungen.