1. Chromogener Assay mit ICB-Substraten im 96-Well-Format
- Enzymreaktion
- Geben Sie den 150 μl 100 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,5 und 5 μl 31 U/ml Endo-Xylanase-Lösung in jede Vertiefung der Assay-Kit-Platte, die rotes ICB-Weizenstroh enthält (endgültige Enzymkonzentration in der Vertiefung: 1 U/ml).
Anmerkung: Die Assay-Kit-Platten (96-Well-Filterplatten mit ICB-Substraten) werden wie in der Literatur beschrieben hergestellt (siehe Materialliste). Die ICB-Substrate sind in Puffern mit einem pH-Bereich zwischen pH 3,0 und 10,0 stabil. Nehmen Sie immer Puffer allein als Negativkontrolle auf, kommerzielle Enzyme als Positivkontrolle und verwenden Sie eine statistisch angemessene Anzahl von Replikaten.
- Aktivieren Sie die ICB-Substrate nicht wie die CPH-Substratplatte, sondern entfernen Sie den Stabilisator durch dreimaliges Waschen mit 100 μl Wasser und anschließende Vakuumfiltration oder Zentrifugation.
- Legen Sie die Produktplatte unter die Substratplatte, um mögliche Leckagen von der Substratplatte während des Schüttelns aufzufangen.
- Inkubieren Sie die Reaktion bei 25 °C und schütteln Sie sie bei 150 U/min für 2 Std.
Anmerkung: Ein aktives Enzym baut die unlöslichen chromogenen Polysaccharide im ICB-Substrat zu löslichen Oligosacchariden ab, die als farbiger Überstand sichtbar sind. ICB-Substrate sind bis zu 90 °C stabil. Die Inkubationszeit sollte auf bis zu 24 Stunden erhöht werden, wenn ungereinigte Enzyme wie z. B. Kulturbrühen verwendet werden.
- Platzieren Sie die Produktplatte mit dem Distanzblock in den Vakuumverteiler.
- Legen Sie die Platte des Assay-Kits darauf und legen Sie ein Vakuum an (maximaler Unterdruck von -60 kPa) oder verwenden Sie eine Zentrifuge, um das Produkt von der Platte des Assay-Kits in die Vertiefung der Produktplatte zu filtrieren.
Anmerkung: Das Filtrat, das die farbigen Oligosaccharide als Reaktionsprodukt enthält, befindet sich nun zur weiteren Analyse in der Auffangplatte.
2. Nachweis und Quantifizierung
- Prüfen Sie durch Sichtprüfung, ob das Flüssigkeitsvolumen in jeder Vertiefung der Auffangplatte ungefähr gleich ist.
- Lesen Sie die Absorption der Auffangplatte bei 517 nm für rotes ICB-Weizenstroh mit einem Plattenleser ab.
- Bei der Datenanalyse – subtrahieren Sie den Puffer – werden nur negative Kontrollwerte von den Werten aus den Vertiefungen ermittelt, in denen ein Enzym hinzugefügt wurde. Berechnen Sie den Mittelwert und den Standardmittelwert (REM) aus den Replizierungsbohrungen.
Anmerkung: Im Falle des Screenings unbekannter Enzyme empfehlen wir, eine Verdünnungsreihe zu erstellen, um detailliertere Daten über den dynamischen Bereich der Enzymaktivität zu erhalten.
