1. Zytotoxizitäts-Assay: Aufbau
- Bereiten Sie Lösungen von Verbindungen von Interesse in den gewünschten Konzentrationen in den entsprechenden Medien vor (serumfrei oder 1, 2,5 oder 5 % FBS RPMI-1640).
- Um die Zytotoxizität einer einzelnen Verbindung zu messen (z. B. um wirksame Dosen zu bestimmen), stellen Sie Verbindungen in einer 2-fachen Endkonzentration her.
- Um die Zytotoxizität von Verbindungskombinationen zu messen, stellen Sie Verbindungen in einer 4-fachen Endkonzentration her.
- Bereiten Sie reine Lösungsmittelkontrollen vor, indem Sie die gleiche Menge Lösungsmittel mit dem entsprechenden Medium mischen. Wenn Sie z. B. in DMSO und Methanol gelöste Verbindungen testen, führen Sie für jedes Lösungsmittel eine reine Lösungsmittelkontrolle durch.
- Die Zellen werden aus der Kulturschale oder dem Kolben in ein konisches 15-ml-Röhrchen gegeben.
- 10 μl Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben und mit 10 μl 0,4 % Trypanblau färben. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um lebensfähige und nicht lebensfähige Zellen für jede Zellquelle zu zählen.
- Pelletzellen bei 200 g für 5 min. Überstand aspirieren oder dekantieren.
- Resuspendieren Sie das Zellgranulat in einem Assay-geeigneten Medium (serumfrei oder 1, 2,5, 5 % FBS RPMI-1640) bei einer Zelldichte von 3*105 Zellen/ml.
ANMERKUNG 1: Eine Zelldichte von 3*105 Zellen/ml ergibt eine Aussaatdichte von 15.000 Zellen/Well. Die Aussaatdichte ist ein wichtiger Parameter und sollte idealerweise vor dem Experiment vordefiniert werden. Bei der Aussaatdichte sollte Folgendes berücksichtigt werden: 1) Zellgröße – in der Regel werden größere Zellen mit einer geringeren Dichte ausgesät; 2) Behandlungsdauer – Zellen werden in der Regel mit einer niedrigeren Dichte ausgesät, um Experimente durchzuführen, die länger dauern, und 3) Zellteilungsrate – Zellen mit einer höheren Teilungsrate werden mit einer geringeren Dichte ausgesät. Spezifische Beispiele für optimierte Aussaatdichten: K562-Zellen, größer, 24 h Dauer – 10.000 Zellen/Well; MOLM-13-Zellen, moderate Größe, 24-Stunden-Behandlung – 15.000/Well; MOLM-13-Zellen, 48-stündige Behandlung – 8.000/Well; kleine gesunde mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs), 24-Stunden-Behandlung – 50.000/Well; primäre AML-Zellen, 24-Stunden-Behandlung – 15.000-20.000/Well.
ANMERKUNG 2: Das Vorhandensein von FBS in Medien kann die Aktivität der Verbindungen beeinflussen. Die Verringerung der FBS-Konzentration kann die Interpretation der Assay-Ergebnisse vereinfachen, verringert aber auch die physiologische Genauigkeit.
- 50 μl Zellsuspension aus Schritt 1,5 mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte geben.
- Fügen Sie Verbindungen wie folgt hinzu:
- Für Einzelverbindungen-Assays geben Sie 50 μl 2x Verbindungslösung in jede Vertiefung. Für Lösungsmittelkontroll-Wells sind 50 μl Testmedium hinzuzufügen, das das Lösungsmittel in der 2-fachen Konzentration enthält.
- Für Kombinationsassays geben Sie 25 μl jeder der Verbindungen (4x Lösungen) in jede Vertiefung. Für Kontrollvertiefungen mit einer Verbindung sind 25 μl 4x Verbindungslösung und 25 μl Prüfmedium hinzuzufügen. Für Vertiefungen zur Lösungsmittelkontrolle fügen Sie 50 μl Prüfmedium oder Prüfmedium hinzu, das das Lösungsmittel enthält.
ANMERKUNG 1: Die Endkonzentration von DMSO sollte 0,5 % nicht überschreiten.
ANMERKUNG 2: Es wird empfohlen, das Medium, das die Verbindungen enthält, mit der Pipette hinzuzufügen, die die Wand jeder Vertiefung berührt, da das Volumen gering ist.
- Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um das Mischen des Inhalts der Vertiefungen sicherzustellen.
Die - Platten werden bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 für eine geeignete Zeit, z. B. 24 h, inkubiert.
2. Zytotoxizitätstest: Färbung mit Hoechst 33342 und Propidiumiodid
- Bereiten Sie 10x Färbelösung vor. Diese Lösung muss vor jedem Versuch frisch zubereitet werden, sie kann nicht gelagert werden. Die endgültigen Farbstoffkonzentrationen sollten vor dem Versuch bestimmt werden.
- Für Leukämiezelllinien und primäre Leukämiezellen enthält 1 ml 10x Färbepuffer 10 μl 20 mM Hoechst 33342 und 50 μl 1 mg/ml Propidiumiodid in sterilem PBS (Endkonzentrationen: Hoechst 33342 20 μM, PI 5 μg/ml).
- Für gesunde PBMCs enthält 1 ml 10x Färbepuffer 10 μl 20 mM Hoechst 33342 und 10 μl 1 mg/ml Propidiumiodid in sterilem PBS (Endkonzentrationen: Hoechst 33342 20 μM, PI 1 μg/ml).
Anmerkung: Die endgültige Konzentration von Propidiumiodid muss vor den Versuchen bestimmt werden. Die Zellen sollten mit einem Bereich von PI-Konzentrationen (1, 2,5, 5 μg/ml) getestet werden, und dann sollte die von Hoechst/PI berechnete Viabilität mit der über Trypanblau gemessenen Viabilität verglichen werden. Die oben aufgeführten PI-Konzentrationen wurden auf der Grundlage der Lebensfähigkeit der Zielzellen in medienkontrollierten Wells ausgewählt (über ~90 % für Leukämiezelllinien, über ~70 % für gesunde PBMCs).
Vorsicht: Hoechst 33342 und Propidiumiodid sind potentielle Karzinogene. Tragen Sie beim Umgang mit ihnen geeignete persönliche Schutzausrüstung.
- Nach der Inkubation verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 10 μl 10x Färbepuffer in jede Vertiefung zu geben.
Anmerkung: Um eine Kreuzkontamination zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitzen das Medium nicht berühren.
- Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um Blasen zu mischen und zu entfernen. Bei 37 °C 15 Min. beizen.
- Zentrifugieren Sie die Platte 4 Minuten lang bei 200 g, um alle Zellen an den Boden der Platte zu bringen. Wischen Sie die Unterseite der Platte vorsichtig mit einem feuchten Kimwipe ab, um Fasern und/oder Ablagerungen zu entfernen, die die Bildgebung beeinträchtigen könnten.
ANMERKUNG 1: Die Zentrifugation der Platte gewährleistet die höchsten Chancen, dass alle Zellen im Bild erfasst werden. Oft lösen sich tote Zellen ab und schwimmen, was irreführende Werte für die Zytotoxizität liefert. Durch die Zentrifugation wird dieser Effekt abgeschwächt.
ANMERKUNG 2: Die Platte sollte nach der Zentrifugation so schnell wie möglich, idealerweise innerhalb von 15 min, abgebildet werden. Die Zentrifugation kann die Selektivität der PI-Färbung verringern und es den Zellen ermöglichen, langsam Propidiumiodid anzuhäufen. Die Verbesserung der Genauigkeit, die durch die Visualisierung der toten Zellen erzielt wird, überwiegt die leichte Zunahme der PI-Färbung
