Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
1. Isolierung von Erythrozyten aus Vollblut
- 500 μl Vollblut in saurer Citratdextrose (ACD) (bei 4 °C gelagert) in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben.
Anmerkung: Vollblut wurde bei ACD gekauft. Nach Angaben des Unternehmens werden 1,5 ml ACD zu 7 ml Vollblut (8,5 ml Gesamtvolumen) hinzugefügt.
- Zentrifugieren Sie das Vollblut bei 700 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT) und entfernen Sie das klare Plasma und den dünnen Buffy-Mantel mit einer Pipette, um die rote Erythrozytenschicht zu verlassen.
- Bereiten Sie 1 l Ringerlösung vor, die 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 32 mM HEPES, 5 mM Glucose und 1 mM CaCl2 enthält. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein, indem Sie 2 μl Tropfen mit 1,0 M NaOH hinzufügen. Um eine glukosefreie Ringer-Lösung herzustellen, befolgen Sie das gleiche Protokoll, aber fügen Sie keine Glukose in die Lösung ein.
- Waschen Sie die Erythrozyten 2x in Ringer-Lösung, indem Sie das Zellpellet in 1,5 ml Ringer-Lösung suspendieren, 5 Minuten lang bei RT bei 700 x g zentrifugieren und den Überstand entfernen.
- Machen Sie einen Hämatokrit von 0,4 %, indem Sie 40 μl des Erythrozytenpellets in 9.960 μl glukosefreier Ringer-Lösung resuspendieren, um ein Endvolumen von 10 ml zu erreichen
Anmerkung: Hämatokrit ist ein Begriff, der sich auf den Volumenanteil von Erythrozyten in Suspension bezieht. Ein Hämatokrit von 0,4 % ist eine Suspension, die 0,4 % Erythrozyten enthält.
- Die Zellsuspension wird 7 Tage lang bei 37 °C inkubiert.
2. Behandlung von Erythrozyten mit Ionomycin und Messung der Hämolyse
- 1 mg Ionomycin-Calciumsalz wird in 630 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, um eine Endkonzentration von 2 mM zu erreichen. Aliquotieren und bei -20 °C lagern.
- Nehmen Sie 1 ml des 0,4%igen Hämatokrits aus Schritt 1.5 und fügen Sie 0,5 μl 2 mM Ionomycin hinzu, um eine Endkonzentration von 1 μM zu erreichen. 2 h bei 37 °C inkubieren.
- Verwenden Sie 1 ml des Hämatokrits ohne Ionomycin-Behandlung als Negativkontrolle.
- Zentrifugieren Sie die mit Ionomycin behandelten und unbehandelten Hämatokrits bei 700 x g für 5 min bei RT und entfernen Sie ihre Überstände, um die Zellpellets am Boden der Röhrchen zu belassen.
- Waschen Sie die Zellen 3x mit Ringer-Lösung, indem Sie die Zellpellets in 1,5 mL Ringer-Lösung suspendieren, 5 Minuten lang bei RT bei 700 x g zentrifugieren und die Überstände verwerfen.
- Um die Hämolyse zu messen, geben Sie 1 ml des unbehandelten Hämatokrits von 0,4 % aus Schritt 1,5 in ein Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie 2 Stunden lang bei 37 °C als Negativkontrolle für die Hämolyse (0 %).
- 1 ml des unbehandelten Hämatokrits von 0,4 % aus Schritt 1,5 in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben und bei 700 x g für 5 min bei RT zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie dem Zellpellet 1 ml destilliertes Wasser hinzu und inkubieren Sie 2 Stunden lang bei 37 °C als Positivkontrolle für die Hämolyse (100 %).
- 1 ml des mit Ionomycin behandelten 0,4%igen Hämatokrits aus Schritt 2.2 in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben.
- Zentrifugieren Sie die unbehandelten Zellen, die behandelten Zellen und die Zellen in destilliertem Wasser bei 700 x g für 5 min bei RT.
- Nehmen Sie 200 μl der Überstände und geben Sie sie in eine 96-Well-Platte.
- Messen Sie die Extinktion bei 541 nm mit einem Mikroplatten-Reader.
- Berechnen Sie die Hämolyse mit Gleichung 1:
%Hämolyse = (AT - A0)/(A100 - A0)*100
wobei A0 die Absorption von Erythrozyten in Ringer-Lösung, A100 die Absorption von Erythrozyten in Wasser und AT die Absorption von behandelten Erythrozyten durch Ionomycin ist.
