Annexin-V-Bindungsassay: Eine fluoreszenzbasierte Technik zur Identifizierung apoptotischer Erythrozyten durch Phosphatidylserin-Markierung

Abstract

Quelle: Bigdelou, P., et al. Induktion von Eryptose in roten Blutkörperchen mit einem Calcium-Ionophor. J. vis. exp. (2020)

In diesem Video demonstrieren wir den Annexin V Bindungsassay zur Messung des Grades der Eryptosis, des Erythrozyten-programmierten Zelltods, mittels fluoreszierender Annexin V Färbung. Apoptotische Erythrozyten zeigen eine Phosphatidylserin-Translokation vom inneren zum äußeren Segel der Zellmembran, wodurch das Fluorophor-markierte Annexin V an das translozierte Phosphatidylserin bindet und dadurch ein Fluoreszenzsignal aussendet.

Protocol

Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.

1. Annexin-V-Bindungsassay

1. 1 mg Ionomycin-Calciumsalz wird in 630 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, um eine Endkonzentration von 2 mM zu erreichen. Aliquotieren und bei -20 °C lagern.
2. Nehmen Sie 1 ml des 0,4%igen Hämatokrits und fügen Sie 0,5 μl 2 mM Ionomycin hinzu, um eine Endkonzentration von 1 μM zu erreichen. 2 h bei 37 °C inkubieren.
3. Die mit Ionomycin behandel....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin V Alexa Fluor 488 - Apoptose-Kit	Fisher Scientific	Nr. A10788	Bei 4 °C lagern
BD FACSAria II Durchflusszytometer	BD Biowissenschaften	643177
Ionomycin-Calciumsalz	EMD Milipore Corp.	Artikel-Nr.: 407952-1MG	In DMSO auflösen, um 2 mM zu erreichen. Bei -20 °C lagern
Zentrifuge	Millipore Sigma	Nr. M7157	Modell Eppendorf 5415C
Einweg-Durchflusszytometrie-Röhrchen mit rundem Boden	VWR	VWRU47729-566
CaCl2	Fisher Scientific	Nr. C79-500
DPBS (Englisch)	VWR Biowissenschaften	SH30028.02
Mikrozentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	Tel.: 02-681-5
Vollblut bei ACD	Zen-Biografie		Bei 4 °C lagern und vor Gebrauch auf 37 °C erwärmen