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Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
1. Annexin-V-Bindungsassay
- 1 mg Ionomycin-Calciumsalz wird in 630 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, um eine Endkonzentration von 2 mM zu erreichen. Aliquotieren und bei -20 °C lagern.
- Nehmen Sie 1 ml des 0,4%igen Hämatokrits und fügen Sie 0,5 μl 2 mM Ionomycin hinzu, um eine Endkonzentration von 1 μM zu erreichen. 2 h bei 37 °C inkubieren.
- Die mit Ionomycin behandelten und unbehandelten Hämatokrits werden bei 700 x g für 5 min bei RT zentrifugiert und ihre Überstände entfernt, um die Zellpellets am Boden der Röhrchen zu belassen.
- Waschen Sie die Zellen 3x mit Ringer-Lösung, indem Sie die Zellpellets in 1,5 mL Ringer-Lösung suspendieren, 5 Minuten lang bei RT bei 700 x g zentrifugieren und die Überstände verwerfen.
- Resuspendieren Sie die mit Ionomycin behandelten und unbehandelten Erythrozytenzellpellets in 1 ml 1x Bindungspuffer.
- Verdünnen Sie 2 mL des 5x Annexin V Bindungspuffers in 8 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um 1x Bindungspuffer zu erhalten.
- Nehmen Sie 235 μl der Zellsuspensionen in den Bindungspuffer und fügen Sie 15 μl Annexin V-Alexa Flour 488 Konjugat hinzu.
- Inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) an einem dunklen Ort. Bei 700 x g für 5 min bei RT zentrifugieren und den Überstand entfernen.
- Waschen Sie die Zellen 2x mit 1x Bindungspuffer, indem Sie das Zellpellet in 1,5 mL des Bindungspuffers suspendieren, bei 700 x g für 5 min bei RT zentrifugieren und den Überstand entfernen.
- Resuspendieren Sie die Zellpellets in 250 μl 1x Bindungspuffer für durchflusszytometrische Messungen.
2. Durchflusszytometrie
- Übertragen Sie 200 μl der mit Annexin V gefärbten Erythrozyten auf 1 ml-Polystyrolröhrchen mit rundem Boden, die mit der Durchflusszytometrie kompatibel sind.
- Melden Sie sich bei der Durchflusszytometrie-Software an und klicken Sie auf die Schaltfläche Neues Experiment. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Röhre. Wählen Sie das globale Blatt aus, und wählen Sie die Option Analyse anwenden, um die Fluoreszenzintensität mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 530 nm zu messen.
- Legen Sie die Anzahl der Zellen auf 20.000 fest, die für die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) entnommen werden sollen.
- Wählen Sie das gewünschte Rohr aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Laden. Klicken Sie auf die Aufnahmetaste für Vorwärts- und Seitenstreumessungen. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Proben.
- Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Schaltfläche Probe und klicken Sie auf Batch-Analyse anwenden, um die Ergebnisdatei zu generieren.
- Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Schaltfläche Probe und klicken Sie auf FSC-Dateien generieren.