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HINWEIS: Als praktischer Anhaltspunkt für die Leser beschreibt die folgende Methodik die spezifischen Kulturbedingungen und Materialien, die für die Messung der Fe-Bioverfügbarkeit von 20 experimentellen Proben erforderlich sind, zuzüglich der erforderlichen Qualitätskontrollen, in einem Lauf des Bioassays. Eine Erhöhung der Anzahl der Proben über diese Kapazität hinaus wird aufgrund des Zeitaufwands für verschiedene Zellkultur- und In-vitro-Verdauschritte innerhalb des Bioassays nicht empfohlen.
1. Auswahl der Anzahl der Proben
- Bei festen oder flüssigen Lebensmitteln ist eine Lebensmittelmenge zu bestimmen, die als repräsentativ für die zu untersuchende Probe angesehen werden kann.
- Bei der Prüfung der Fe-Bioverfügbarkeit einer Bohnensorte werden 100-150 g Bohnensamen verwendet und diese Menge zu einer homogenen Probe verarbeitet.
- Bei flüssigen Proben wie angereicherten Säften, Milchprodukten und Sportgetränken ist sicherzustellen, dass die Lebensmittel vor der Probenahme gut vermischt sind.
HINWEIS: Die oben erwähnte Menge an Bohnensaatgut ist wichtig, um die inhärenten Unterschiede zwischen den Samen dieser Grundfrucht zu berücksichtigen.
2. Vorbereitung der Proben
- Spülen Sie vor der Verarbeitung Schmutz und Staub von allen Lebensmittelproben mit destilliertem-deionisiertem Wasser ab.
- Verarbeiten Sie die entsprechende Probenmenge gemäß den Versuchszielen, z. B. durch Kochen und Mahlen.
HINWEIS: Zum Kochen und Verarbeiten ist es wichtig, Kochgeschirr und -geräte zu verwenden, die keine potenzielle Quelle für Fe-Verunreinigungen darstellen. Geräte aus rostfreiem Stahl verunreinigen nicht; Geräte wie Steinmühlenmühlen, Kochgeschirr aus Gusseisen und andere Geräte, die nicht aus Edelstahl stammen, können jedoch erhebliche Mengen an Fe-Verunreinigungen hinzufügen. Zum Mahlen ist oft eine handelsübliche Kaffeemühle aus Edelstahl ausreichend.
- Lyophilisieren und zu einem homogenen Pulver mahlen.
HINWEIS: Nach der Homogenisierung hat die Forschung gezeigt, dass drei unabhängige Replikationen der Analyse für jedes zu messende Lebensmittel ausreichend sind.
- Wenn die Homogenität der Probe schwer zu erreichen ist, überarbeiten Sie die Rezeptur oder Verarbeitung des Produkts. Wenn dies nicht möglich ist, fügen Sie Replikationen hinzu, wenn die Inhomogenität nicht schwerwiegend ist.
- Für die meisten homogenen festen Lebensmittel verwenden Sie 0,5 g lyophilisierte Probe pro Replikat. Falls erforderlich, verwenden Sie bis zu 1,0 g Probe pro Replikat, aber prüfen Sie, ob mehr als 0,5 g einen Vorteil im Ansprechgrad bringen.
HINWEIS: Mengen von mehr als 0,5 g fester Nahrung können die Dialysemembran verstopfen (siehe unten).
- Verwenden Sie 1-2 mL flüssige Proben.
Anmerkung: Bei flüssigen Proben ist eine Lyophilisierung oft nicht erforderlich.
3. Caco-2-Zellkultur
- Stammkulturen
- Erwerben Sie Caco-2-Zellen von einem zertifizierten Lieferanten.
- Kultivieren Sie die Zellen aus Standardfläschchen bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO2 -Luftatmosphäre (konstante Luftfeuchtigkeit) unter Verwendung von Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), ergänzt mit 25 mM HEPES (pH 7,2), 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % antibiotisch-antimykotischer Lösung.
- Sobald genügend Zellen verfügbar sind, in der Regel nach 7-10 Tagen Kultur, säen Sie die Zellen in nicht kollagenbeschichteten Kolben mit einer Dichte von 30.000 Zellen/cm2 aus.
- Wählen Sie die Kolbengröße in Abhängigkeit von der Anzahl der verfügbaren Zellen, die für die Aussaat von Multiwell-Platten benötigt werden.
HINWEIS: Im Allgemeinen eignen sich die T225-Kolben (225 cm2) am besten für Experimente, bei denen 11 Multiwell-Platten (6 Wells; 9,66 cm2/Well) pro Bioassay verwendet werden (10 Platten für Probenvergleiche, 1 Platte für Qualitätskontrollen).
- Züchten Sie die Zellen 7 Tage lang in Kolben, wechseln Sie das Medium alle zwei Tage und verwenden Sie sie am 7. Tag für die Aussaat der Multiwell-Platten.
HINWEIS: Es wird empfohlen, einen Durchgangsbereich von nicht mehr als 10-15 Durchgängen zu verwenden, nachdem die Zellen aus der Stammkultur entnommen und anschließend in einer Reihe von Experimenten verwendet wurden. Zellkulturpassagen sollten begrenzt werden, da ein breites Spektrum von Passagen zu adaptiven Veränderungen in der Zelllinie und damit zu Variabilität in der Reaktion des Modells führen kann.
- Zellkultur auf Multiwell-Platten
- Aussaat der Caco-2-Zellen mit einer Dichte von 50.000 Zellen/cm2 in kollagenbeschichteten 6-Well-Platten.
HINWEIS: Dieser Schritt funktioniert in der Regel am besten, wenn er an einem Mittwoch ausgeführt wird. In den folgenden Schritten wird deutlich, warum dieser Wochentag optimal ist.
- Züchten Sie die Zellen 12 Tage lang bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO2 -Luftatmosphäre (konstante Luftfeuchtigkeit) unter Verwendung von DMEM, ergänzt mit 25 mM HEPES (pH 7,2), 10 % (v/v) FBS und 1 % antibiotisch-antimykotischer Lösung.
HINWEIS: Die Kultivierung der Zellmonoschichten länger als 12 Tage kann zu einem Überwachsen der Zellen führen. Frühere Forschungen haben eindeutig gezeigt, dass unter diesen Bedingungen 12 Tage nach der Aussaat die Zellmonoschicht reif ist, gut an der Platte befestigt ist und eine optimale Konsistenz der Reaktion aufweist. Ein längeres Wachstum der Zellen, z. B. bis zu 19-21 Tage, führt zu einem Überwachsen der Zellen, und das Medium verbraucht schnell keine Nährstoffe, was zu ungesunden Monoschichten führt.
- Wechseln Sie während des Zeitraums von 12 Tagen das Medium mindestens alle 2 Tage nach einem einheitlichen Tagesplan.
- Ersetzen Sie das Nährmedium am 12. Tag nach der Aussaat durch 2 ml Minimum Essential Medium (MEM [pH 7]), ergänzt mit 10 mM PIPES (Piperazin-N,N'-bis-[2-ethansulfonsäure]), 1% antibiotisch-antimykotischer Lösung, Hydrocortison (4 mg/L), Insulin (5 mg/L), Selen (5 μg/L), Trijodthyronin (34 μg/L) und epidermalem Wachstumsfaktor (20 μg/L).
HINWEIS: Wenn die Aussaat an einem Mittwoch begonnen wurde, dann wäre der 12. Tag ein Montag.
- Entfernen Sie am nächsten Tag (d. h. am 13. Tag) das MEM und ersetzen Sie es durch 1 mL MEM (pH 7).
HINWEIS: Dieser Schritt erfolgt an einem Dienstag. Dies ist der Tag, an dem der Bioassay beginnt. Somit bietet der 13-Tage-Zeitplan den Vorteil eines konsistenten Wochenplans, so dass der Bioassay konsistent am selben Wochentag durchgeführt werden kann.
4. In-vitro-Aufschluss
- Vorbereitung der Einsatzringe
- Erstellen Sie einen sterilisierten Einsatzring mit einem Silikon-O-Ring, der mit einer säuregewaschenen Dialysemembran ausgestattet ist (Abbildung 1A).
HINWEIS: Bereiten Sie die Einsätze 1 Tag vor (d. h. Montag, Tag 12) des Tages des Bioassays vor und lagern Sie sie bis zur Verwendung in 18 MΩ Wasser bei 4 °C.
- Am Tag des Bioassays (Dienstag, Tag 13) nehmen Sie die Einsätze aus dem Kühlschrank, lassen Sie es ab und ersetzen Sie das Wasser durch 0,5 M HCl. Lassen Sie es vor der Verwendung mindestens 1 h bei Raumtemperatur in einer Laminar-Flow-Haube.
HINWEIS: Dieser Schritt sollte durchgeführt werden, bevor das MEM von den Kulturplatten entfernt wird. Die saure Waschung der Membran dient der Entfernung von eventuell kontaminierendem Fe und sterilisiert den Einlegering und die Membran.
- Lassen Sie die 0,5 M HCl aus den Einsätzen ab und spülen Sie sie mit sterilem Wasser 18 MΩ ab. Bis zur Verwendung in sterilem Wasser mit 18 MΩ bei Raumtemperatur in einer Laminar-Flow-Haube lagern.
- Setzen Sie in jede Vertiefung der 6-Well-Platten mit Caco-2-Zellen einen Ring ein, wodurch ein Zweikammersystem entsteht. Legen Sie die Platten mit den Einsätzen wieder in den Inkubator.
HINWEIS: Dieser Schritt sollte durchgeführt werden, nachdem frische 1,0 ml MEM in jede Vertiefung gegeben wurden (siehe Schritt 3.2.5.).
- Herstellung der Pepsinlösung
- Am Tag des Versuchs wird die Pepsinlösung hergestellt, indem 0,145 g Pepsin in 50 ml 0,1 M HCl aufgelöst werden. Die Lösung wird auf einem Plattformschüttler 30 Minuten lang bei Raumtemperatur vorsichtig geschüttelt
.
- Zubereitung der Pankreatin-Galle-Lösung
- Am selben Tag wie der Versuch werden 0,1 M NaHCO3 hergestellt, indem 2,1 g NaHCO3 in 250 ml 18 MΩ Wasser gelöst werden.
- Mischen Sie 0,35 g Pankreatin und 2,1 g Gallenextrakt in 175 ml 0,1 M NaHCO3.
- Sobald das Pankreatin und der Gallenextrakt löslich sind, 87,5 g eines schwachen Kationenaustauscherharzes hinzufügen (siehe Materialtabelle) und durch 30-minütiges Schütteln bei Raumtemperatur mischen.
- Gießen Sie die Aufschlämmung in eine große Säule und sammeln Sie das Eluat.
- Eluieren Sie die Säule mit zusätzlichen 70 mL 0,1 M NaHCO3 und sammeln Sie dieses Volumen in der Pankreatin-Gallenlösung.
HINWEIS: Der Zweck des Harzes besteht darin, Verunreinigungen Fe zu entfernen, die häufig in den Pankreatin-Galle-Extrakten enthalten sind.
- Initiieren Sie die In-vitro-Verdauung.
- Die Probe wird in einem sterilen 50-ml-Zentrifugenröhrchen (Polypropylen) gewogen, gefolgt von der Zugabe von 10 mL physiologischer Kochsalzlösung bei pH 2, die 140 mM NaCl und 5 mM KCl enthält.
- Der Magenaufschluss wird eingeleitet, indem 0,5 ml der vorbereiteten Schweinepepsinlösung in die Probe gegeben und auf einem Schaukelschüttler bei niedriger, sanfter Einstellung 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert wird.
- Nach dieser Zeit wird der Darmverdauungsprozess jeder Probe eingeleitet, indem der pH-Wert mit 1,0 M NaHCO3 auf 5,5-6,0
eingestellt wird.
- Geben Sie 2,5 mL der Pankreatin-Galle-Lösung in jedes Probenröhrchen und stellen Sie den pH-Wert mit 1,0 M NaHCO3 auf 6,9-7,0 ein.
- Sobald der pH-Wert eingestellt ist, gleichen Sie das Volumen in jedem Röhrchen mit 140 mM NaCl und 5 mM KCl (pH 6,7) Lösung aus und messen Sie das Gewicht des Röhrchens mit einem Zielwert von 15 g.
HINWEIS: Bei einigen Lebensmitteln kann es erforderlich sein, das Gesamtvolumen auf 16 g oder 17 g zu erhöhen, abhängig von der Pufferkapazität der Lebensmittel.
- Übertragen Sie 1,5 ml jedes Darmdigests in die obere Kammer (d. h. die den Einsatzring mit der Dialysemembran enthält) einer entsprechenden Vertiefung der 6-Well-Kulturplatte, die die Caco-2-Zellen enthält (Abbildung 1B).
- Die Plattenabdeckung wieder aufsetzen und bei 37 °C (5 % CO2 -Luftatmosphäre) auf einem Wippschüttler bei 6 Schwingungen/min für 2 h inkubieren.
- Entfernen Sie den Einsatzring mit dem Aufschluss und geben Sie zusätzlich 1 ml MEM (pH 7) in jede Vertiefung
.
- Die Zellkulturplatte für weitere 22 Stunden in den Inkubator (37 °C; 5 % CO2 -Luft) stellen.
- Entfernen Sie nach 22 Stunden das Zellkulturmedium und geben Sie 2,0 ml 18 MΩ Wasser in die Zellmonoschicht.
HINWEIS: Das Wasser lysiert die Zellen osmotisch.
- Ernten Sie das gesamte Zelllysat in Standard-Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen oder ähnlichem für nachfolgende Zellprotein- und Zellferritinanalysen.
