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HINWEIS: Alle Eingriffe müssen in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II bei eingeschaltetem Gebläse und ausgeschaltetem Licht durchgeführt werden.
1. Vorbereitung der Materialien
HINWEIS: Alle Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.
- Bereiten Sie Medium 1, Zentrifugationsmedium 2 und Lagerungs- und Arbeitslösungen von fluoreszierender 2-Desoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl)-amino]-D-glucose (2-NBDG oder FD-glucose) gemäß Tabelle 1 in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II vor. Schützen Sie FD-Glukose während des gesamten Experiments vor Licht, indem Sie alle Lichter unter der Haube ausschalten.
- Verwenden Sie gebrauchsfertige Zellkulturreagenzien: Trypsin-EDTA, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und glukosefreie und phenolrotfreie Dulbecco's Modified Eagle Medium (im Folgenden glukosefreies DMEM).
- Verwenden Sie 20 ml RIPA-Lysepuffer (Radioimmunoprecipitation Assay).
HINWEIS: In den folgenden Abschnitten werden die extrazelluläre Depletion und die intrazelluläre Aufnahme verschiedener FD-Glukosedosen in 3T3-L1-Fibroblasten mit und ohne Insulinstimulation verglichen (Abbildung 1).
2. 3T3-L1-Zellkultur und -Wartung
- Kultivieren Sie 3T3-L1-Maus-Fibroblasten durch Plattieren von 1 x 106 Zellen, verdünnt in 20 ml Medium 1 in zwei 96-Well-Platten. Platte 100 μl Zellsuspension pro Well, um die Homogenität dieser Suspension durch Mischen zu erhalten. Züchten Sie die Zellen 48 h lang in einem 37 °C Inkubator (5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit) ohne Medienwechsel bis zu einer Konfluenz von ca. 70%-80%.
- Halten Sie die Zellen konfluent und nüchtern, indem Sie sie 48 Stunden lang im selben Medium kultivieren. Variieren Sie die Inkubationszeit von 24-72 Stunden, abhängig vom gewünschten nüchternen katabolen Zustand.
3. Hunger von 3T3-L1-Zellen
- Dekantieren Sie Medien aus den Zellen in den 96-Well-Platten. Nehmen Sie die restliche Flüssigkeit mit sterilen Papiertüchern auf.
- Spülen Sie die 96-Well-Platte mit 100 μl PBS pro Well und nehmen Sie die restliche Flüssigkeit mit sterilen Papiertüchern auf.
- 100 μl glukosefreies DMEM pro Vertiefung zugeben und 40 Minuten inkubieren. Passen Sie die Inkubationszeit je nach Zelltyp, Reizen und gewünschtem Fastengrad an.
HINWEIS: Die Inkubationszeit kann je nach Jahreszeit optimiert werden müssen.
4. Herstellung von FD-Glukoselösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen
HINWEIS: Das Experiment in Abbildung 1 untersucht extrazelluläre und interzelluläre Medien mit und ohne Stimulation mit Insulin.
- Verwenden Sie acht Replikate (eine Reihe in einer 96-Well-Platte) für jede Stimulationsbedingung. Bereiten Sie daher 1 ml für jede Stimulationsbedingung vor (angegeben in Tabelle 2 und unten).
- Verwenden Sie acht Stimulationsbedingungen ohne Insulin: FD-Glukose von 2,5 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 0,2 μg/ml, 0,1 μg/ml, 0,05 μg/ml und 0 μg/ml (Kontrolle ohne FD-Glukose) in einer 96-Well-Platte.
- Verwenden Sie acht Stimulationsbedingungen mit Insulin (10 μg/ml, Endkonzentration): FD-Glukose von 2,5 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 0,2 μg/ml, 0,1 μg/ml, 0,05 μg/ml und 0 μg/ml (Kontrolle ohne FD-Glukose) in einer weiteren 96-Well-Platte.
- Zur Vorbereitung der Stimulationsbedingungen verdünnen Sie 1 μl 5 mg/ml FD-Glukose-Arbeitslösung (Tabelle 1) in 999 μl glukosefreiem DMEM, um 1 ml Arbeitsstofflösung (1:1000 Verdünnung oder 5 μg/ml) zu erhalten.
- Bereiten Sie unter Verwendung dieser Arbeitstierlösung Verdünnungen von 1:2000, 1:5000, 1:10.000, 1:25.000, 1:50.000 und 1:100.000 FD-Glucose vor, um 2,5 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 0,2 μg/ml, 0,1 μg/ml und 0,05 μg/ml (Tabelle 2) in 2-ml-Röhrchen unmittelbar vor Experimenten in einer Biosicherheitswerkbank ohne Beleuchtung zu erhalten.
- Schritt 4.4 wiederholen und 1 μl Insulin (10 mg/ml, Endkonzentration) zu jeder der oben genannten Bedingungen hinzufügen.
HINWEIS: Die endgültige Insulinkonzentration in diesen Proben beträgt 10 μg/ml = 1,7 nmol/ml. Um eine Homogenisierung zu erreichen, geben Sie Insulin in die Röhrchen, bevor Sie andere Lösungen hinzufügen.
5. Behandlung von ausgehungerten 3T3-L1-Zellen
- Nach 40 Minuten Inkubation wird das glukosefreie DMEM aus jeder Vertiefung in 96-Well-Platten umgefüllt und die restliche Flüssigkeit mit sterilen Papiertüchern absorbiert.
- Geben Sie jeweils 100 μl (pro Vertiefung) aus den verschiedenen oben beschriebenen Behandlungsbedingungen in die Vertiefungen entlang einer Säule und 100 μl (pro Vertiefung) aus derselben Vertiefung in die Vertiefungen entlang der Reihe (acht Replikate) in beiden 96-Well-Platten. Beschriften Sie die Platten, die die Bedingungen verwendet haben, mit und ohne Insulin. Geben Sie nur glukosefreies DMEM in die Kontrollvertiefungen (n = 8).
- Inkubieren Sie die Platte 40 min lang in einem Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit) im Dunkeln.
6. Extrazelluläre und interzelluläre Messungen für stimulierte 3T3-L1-Zellen
- Nachdem die Zellen 40 Minuten lang stimuliert wurden, übertragen Sie das Stimulationsmedium von beiden Platten in neue 96-Well-Platten, wobei das experimentelle Layout beibehalten wird.
- Dekantieren Sie die restliche Lösung von den original stimulierten 96-Well-Platten mit Zellen auf sterile Papiertücher.
- Optional Waschzellen mit PBS. Entfernen Sie PBS und füllen Sie die restliche Lösung auf sterile Papiertücher um.
- Geben Sie 100 μl des RIPA-Lysepuffers in jede Vertiefung. Optional können Sie dem RIPA-Puffer einen Proteaseinhibitor hinzufügen, um die Proteine zu schützen. Teller mit RIPA für 30 min in einen Shaker geben.
- Messen Sie mit einem Mikroplatten-Reader (Table of Materials) die Fluoreszenz bei Anregungs- (Ex) und Emissionswellenlängen (Em) von 485 bzw. 535 nm, zuerst in dem Medium, das extrazelluläre FD-Glukose enthält, und dann am Ende der 30-minütigen Inkubation auf der Platte mit RIPA-lysierten Zellen (siehe Schritt 6.4).
Tabelle 1: Vorbereitung von Nährmedien und FD-Glukoselösungen.
| Lösung/Medium | Komponenten |
| Ethanol:DMSO (1:1/v/v) | Ethanol (200 μl) und DMSO (200 μl) in 1-1,5 mL Röhrchen; verwenden Sie Ethanol und DMSO in Zellkulturqualität |
| Mittel 1 | DMEM (89 mL), Penicillin/Streptomycin (1%) (1 mL) und Kälberserum (10 %) (10 mL) in sterilem 50 mL Röhrchen |
| Zentrifugationsmedium 2 | DMEM (89 mL), Penicillin/Streptomycin (1%) (1 mL) und Rinderserum (10%) (10 mL) in sterilem 50 mL Röhrchen |
| Lagerung FD-Glukoselösung 5 mg/mL (14,5 mM) | FD Glukose (1 mg) und Ethanol:DMSO (1:1/v/v) (200 μl) in 0,5 mL Röhrchen; lagern bei -80 °C, vorzugsweise unter Argon- oder Stickstoffatmosphäre |
| Arbeits-FD-Glukoselösung 5 μg/mL (14,5 mM) | Lagerung FD Glukoselösung 5 mg/ml (1 μl), glukosefreies DMEM (999 μl); unmittelbar vor dem Experiment vorbereiten. |
Tabelle 2: Herstellung von FD-Glukoselösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen für die in Abbildung 1 gezeigten Experimente.
cm
cm
cm
cm
cm
kg
kg
kg
kg
kg
| Verdünnung | Steuerung | 1:2x103 | 1:5x103 | 1:1x104 | 1:2,5x104 | 1:5x104 | 1:1x105 |
| Konzentration (μg/mL) | 0 | 2,5 | 1 | 0,5 | 0,2 | 0,1 | 0,05 |
| Glukosefreies DMEM (μL) | 1000 | 500 | 800 | 900 | 960 | 980 | 990 |
| FD Glukose 5 μg/mL (μL) | 0 | 500 | 200 | 100 | 40 | 20 | 10 |
