Messung der extrazellulären fluoreszierenden Glukoseanaloga-Depletion: Eine Surrogat-Messtechnik zur Beurteilung der Glukoseaufnahme in Mausorganen ex vivo

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Kumar, S. B. et al., Extrazellulärer Glukosemangel als indirektes Maß für die Glukoseaufnahme in Zellen und Geweben ex vivo.J. Vis. Exp.(2022)

In diesem Video demonstrieren wir eine ex vivo-Technik zur Messung der extrazellulären Glukoseanaloga-Depletion in entnommenen Mausorganen. Dabei wird das Mausgewebe in einer Lösung inkubiert, die fluoreszenzmarkierte Desoxyglukose enthält, die von den Zellen aufgenommen wird. Die Glukoseanalogonaufnahme kann indirekt durch Messung der Fluoreszenz des inkubierten Mediums bestimmt werden.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

HINWEIS: Alle Eingriffe müssen in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II bei eingeschaltetem Gebläse und ausgeschaltetem Licht durchgeführt werden.

1. Vorbereitung der Materialien

HINWEIS: Alle Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

Bereiten Sie Medium 1, Zentrifugationsmedium 2 und Lagerungs- und Arbeitslösungen von fluoreszierender 2-Desoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl)-amino]-D-glucose (2-NBDG oder FD-glucose) gemäß Tabelle 1 in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II vor. Schützen Sie FD-Glukose während des gesamten Experiments vor Licht, indem Sie alle Lichter unter der Haube ausschalten.
Verwenden Sie gebrauchsfertige Zellkulturreagenzien: Trypsin-EDTA, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und glukosefreie und phenolrotfreie Dulbecco's Modified Eagle Medium (im Folgenden glukosefreies DMEM).

2. Ex-vivo-Messung der extrazellulären FD-Glukosedepletion in Organen

Mäuse vor der Organdissektion wie folgt mit Verbindungen vorbehandeln, die den Glukosestoffwechsel stimulieren.
Verwenden Sie neun Wochen alte Lep^ob männliche Mäuse (n = 11). Füttern Sie alle Mäuse vor dem Experiment mit einer regelmäßigen Futterdiät.
Ordnen Sie die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen für intraperitoneale (i.p.) Injektionen ein.
1. Injizieren Sie Mäusen aus der Kontrollgruppe Lep^ob 0,1 ml steriles PBS (n = 4).
2. Injizieren Sie Mäusen aus der Insulin Lep ob-Gruppe 0,1 ml steriles PBS, das 12 IE Humaninsulin pro Gramm Körpergewicht (KG) (n = 3) enthält.
3. Injizieren Sie Mäusen aus der AAC2-Lep-ob-Gruppe 0,1 ml steriles PBS, das 0,1 nmol AAC2 pro Gramm Körpergewicht (KG) enthält (n = 4).
Nach 15 Minuten werden die Mäuse einer Inhalation von 5 % Isofluran und Exsanguinatblut durch Herzpunktion der anästhesierten Tiere unterzogen.
Präparieren Sie viszerales epidydmales weißes Fettgewebe (200 mg), Leber (200 mg) und das gesamte Gehirn von jedem Tier. Verwenden Sie eine Biosicherheitshaube der Klasse II für den Umgang mit Gewebe.
Bereiten Sie die Arbeitslösung FD-Glucose (0,29 mM) in glukosefreiem DMEM in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II ohne Licht vor.
Messen Sie die Fluoreszenz von FD-Glukose-Arbeitslösung (0,29 mM) bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 485 nm bzw. 535 nm mit einem Mikroplatten-Reader.
Inkubieren Sie die entnommenen Gewebe/Organe in einer 6-Well-Platte, die PBS enthält, für 1 min. Behandeln Sie jedes Gewebe oder Organ in einer separaten Vertiefung.
Legen Sie nach 1 Minute jedes Taschentuch auf ein steriles Papiertuch, um PBS aufzunehmen. Gewebe/Organe in eine separate 6-Well-Platte mit 4.000 μl glukosefreiem DMEM überführen und 2 Minuten lang inkubieren.
Nach 2 Minuten das Gewebe herausnehmen und in Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit 0,29 mM FD-Glukose-Arbeitslösung (1 ml/Well) übertragen. Die 6-Well-Platten mit Geweben werden in FD-Glukose-Arbeitslösung bei 37 °C (5 % CO₂ und 95 % Luftfeuchtigkeit) inkubiert.
Sammeln Sie 100 μl FD-Glukose-Arbeitslösung aus jeder Vertiefung nach 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 und 120 Minuten Inkubation, um die Kinetik des extrazellulären FD-Glukosemangels zu analysieren. Vor und nach der Entnahme schütteln.
Übertragen Sie 100 μl FD-Glukose-Arbeitslösung in 96-Well-Platten, um die Fluoreszenz bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 485 bzw. 535 nm mit einem Mikroplatten-Reader zu messen.
Normalisieren Sie die Fluoreszenz auf den 0-min-Wert (100 %) für jedes Organ in jedem Tier (Abbildung 1).

Tabelle 1: Vorbereitung von Nährmedien und FD-Glukoselösungen.

Lösung/Medium	Komponenten
Ethanol:DMSO (1:1/v/v)	Ethanol (200 μl) und DMSO (200 μl) in 1-1,5 mL Röhrchen; verwenden Sie Ethanol und DMSO in Zellkulturqualität
Mittel 1	DMEM (89 mL), Penicillin/Streptomycin (1%) (1 mL) und Kälberserum (10 %) (10 mL) in sterilem 50 mL Röhrchen
Zentrifugationsmedium 2	DMEM (89 mL), Penicillin/Streptomycin (1%) (1 mL) und Rinderserum (10%) (10 mL) in sterilem 50 mL Röhrchen
Lagerung FD-Glukoselösung 5 mg/mL (14,5 mM)	FD Glukose (1 mg) und Ethanol:DMSO (1:1/v/v) (200 μl) in 0,5 mL Röhrchen; lagern bei -80 °C, vorzugsweise unter Argon- oder Stickstoffatmosphäre
Arbeits-FD-Glukoselösung 5 μg/mL (14,5 mM)	Lagerung FD Glukoselösung 5 mg/ml (1 μl), glukosefreies DMEM (999 μl); unmittelbar vor dem Experiment vorbereiten.

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Ergebnisse

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Abbildung 1: Kinetik des extrazellulären FD-Glukosemangels in verschiedenen Organen ex vivo. (A-C) Lep^ob-Mäuse wurden mit Vehikel (PBS, n = 4), Insulin (12 IE/kg KG, n = 3) und AAC2 (1 nmol/g KG, n = 3) injiziert. Nach 15 Minuten wurde das Gewebe präpariert und isoliert. Explantate von (A) viszeralem Fett, (B) Leber un...