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Alle Verfahren, an denen menschliche Teilnehmer beteiligt sind, wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft
1. Messung der Kontraktion (Beispiel-SMCs)
- Bereiten Sie ein 96w10e ECIS-Array vor (siehe Abbildung 1A für ein repräsentatives Bild des Arrays mit vergrößerten Elektroden und Zellen, die auf den Elektroden bestückt sind).
HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte unter einer Laminar-Flow-Haube mit steriler Gewebekultur durch.
- Beschichten Sie ein steriles 96w10e-Array 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 200 μl 10 mM L-Cystein pro Well.
- Waschen Sie den Teller zweimal mit sterilem Wasser. Lassen Sie die Platte über Nacht in der Gewebekulturhaube bei leicht geöffnetem Deckel trocknen.
HINWEIS: Das Beschichten der Platte mit L-Cystein ist nur bei der ersten Verwendung der Platte notwendig.
- Am nächsten Tag die Platte und den Deckel 30 Minuten lang UV-sterilisieren. Drehen Sie den Deckel nach oben, so dass das Innere sterilisiert ist. Sobald die Platte sterilisiert ist, öffnen Sie die Platte nicht außerhalb der Durchflusshaube.
- Seeding von Zellen auf dem ECIS-Array
- 1%ige sterile Gelatinelösung im Wasserbad 30 Min. vorwärmen
HINWEIS: Die Lösung wird im Kühlschrank aufbewahrt und kann sich verfestigen, was das Pipettieren erschwert.
- Anschließend werden die Vertiefungen mit 100 μl der 1 %igen Gelatinelösung pro Vertiefung bestreicht und die Platte mindestens 1 h lang bei 37 °C inkubiert.
- Saugen Sie die Gelatine aus den Vertiefungen ab.
- Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler und säen Sie die SMCs in dreifacher Ausfertigung bei einer Aussaatdichte von 30.000 Zellen/Well in 200 μl SMC-Medium aus.
- Legen Sie die Platte mit den SMCs in den ECIS 96-Well-Halter im Zellkultur-Inkubator. Doppelklicken Sie auf die ECIS Applied Biophysics Software, um das Programm zu öffnen, und drücken Sie die Setup-Taste.
- Prüfen Sie, ob alle Elektroden Kontakt mit der Halterung (grün, rot, wenn keine Verbindung) in der linken unteren Blende mit der Bezeichnung "Well-Konfiguration" haben. Wenn die Elektroden nicht richtig angeschlossen sind, stellen Sie die Platte in der Halterung ein, bevor Sie die Messung starten.
- Wählen Sie den Plattentyp (96-Well-Array) im selben Fenster aus, indem Sie auf Array-Typ klicken.
- Klicken Sie im rechten oberen Bereich Datenerfassungseinrichtung auf Einzelfrequenz und ändern Sie den Impedanzwert auf 4000 Hz und das Intervall auf 8 s.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um die Messungen zu starten. Warten Sie, bis sich ein neues Fenster öffnet, in dem die ECIS-Datei gespeichert werden kann.
- Lassen Sie die Zellen sich anheften und bilden Sie eine Monoschicht für 48 h.
HINWEIS: Durch das Anbringen und Spreizen der Zellen auf den Elektroden wird ein Basiswiderstandswert erzeugt (Abbildung 1B).
- Stimulation der Zellen zur Induktion der Kontraktion
- Induzieren Sie die SMC-Kontraktion, indem Sie die Zellen mit 10 μg/ml des Calcium-Ionophors Ionomycin stimulieren.
HINWEIS: Ionomycin induziert den Einstrom von extrazellulärem Ca2+ und aktiviert die kontraktile Kaskade; siehe Abbildung 2A für repräsentative Bilder von nicht stimulierten und stimulierten kontrahierten Zellen.
- 1 mg Ionomycinpulver in 100 μl Dimethylsulfoxid zu einer Stammlösung von 10 mg/ml verdünnen und 10 μl Aliquote bei -20 °C lagern. Verdünnen Sie die Ionomycinlösung vor der Verwendung 1:10 im SMC-Medium, um die Arbeitslösung vorzubereiten, die den Zellen zugesetzt werden soll.
- Führen Sie die Zellstimulation durch, während sich das Array noch in der Array-Halterung im Zellkultur-Inkubator befindet und die Elektroden am System befestigt sind.
- Um die Zellen zu stimulieren, nehmen Sie den Deckel ab und legen Sie ihn auf eine sterile Oberfläche im Inneren des Inkubators. Bereiten Sie zwei Pipetten vor, die auf 2 μl und 150 μl eingestellt sind.
- Bevor Sie die Stimulation starten, drücken Sie in der Software auf Markieren und geben Sie einen Kommentar ab.
HINWEIS: Dies erleichtert es, den genauen Zeitpunkt der Stimulation bei der Analyse der Daten zu finden.
- Pipettieren Sie so schnell wie möglich 2 μl der Ionomycin-Arbeitslösung in jede Vertiefung. Sobald alle Zellen stimuliert wurden, mischen Sie das Medium in den Vertiefungen mit der zweiten Pipette.
HINWEIS: Aufgrund der schnellen Wirkung ist es nicht notwendig, die Spitzen zwischen verschiedenen Zelllinien und Bedingungen zu wechseln. Arbeiten Sie schnell beim Stimulieren und Mischen, da das Ionomycin eine akute Wirkung hat. Wenn Sie eine volle Platte stimulieren, stimulieren Sie maximal 3 Säulen auf einmal. Warten Sie nach jeder Stimulation mindestens 30 Minuten bis zur nächsten Stimulation, damit sich die Zellen von der Temperatur- und CO2 -Veränderung erholen können, die durch das Öffnen der Inkubatortür verursacht wurde.
- Direkt nachdem die Stimulation abgeschlossen ist, drücken Sie erneut auf Markieren, um einen Kommentar hinzuzufügen, dass die Stimulation abgeschlossen ist.
- Abschluss des Stimulationsexperiments
- Zeichnen Sie die Impedanzwerte ca. 5 Minuten nach der Ionomycin-Stimulation auf. Beenden Sie die Aufnahme, indem Sie auf Fertig stellen.
