Der gleitende Aktinfilament-Assay: Ein In-vitro-Motilitätsassay zur Untersuchung der Translokation von Aktinfilamenten auf immobilisierten Myosinen

Zusammenfassung

Quelle: Tripathi, A., et al. Myosin-spezifische Anpassungen von In-vitro-Fluoreszenzmikroskopie-basierten Motilitätsassays. J. Vis. Exp. (2021).

In diesem Video führen wir einen in vitro Motilitätsassay durch, um die Aktin-Myosin-Wechselwirkungen zu analysieren. Die Gleitbewegung von Aktinfilamenten auf immobilisierten Myosinmolekülen wird mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht.

Protokoll

1. Gleitender Aktin-Filament-Assay

1. Vorbereitung des Deckglases
   1. Stelle eine 1%ige Nitrocelluloselösung in Amylacetat her.
   2. Besorgen Sie sich eine Gewebekulturschale (150 x 25 mm) und legen Sie ein kreisförmiges Filterpapier (125 mm Durchmesser) auf den Boden der Schale.
   3. Legen Sie acht quadratische Deckgläser mit einer Stärke von 22 mm Nr. 1,5 auf ein Gestell und waschen Sie es mit ca. 2-5 ml 200-prozentigem Ethanol, gefolgt von 2-5 ml destilliertem Wasser (dH₂O). Wiederholen Sie diesen Waschschritt und beenden Sie ihn mit Wasser. Trocknen Sie dann die Deckgläser vollständig mit einer gefilterten Luftleitung oder N_2-Leitung.
   4. Nehmen Sie ein Deckglas und pipettieren Sie langsam 10 μl der 1%igen Nitrozelluloselösung entlang einer Kante des Gleittuchs. Schmieren Sie es dann in einer sanften Bewegung mit der Seite einer glatten 200-μl-Pipettenspitze über den Rest des Deckglases. Legen Sie dieses Deckglas mit der Nitrozellulose-Seite nach oben auf die Gewebekulturschale. Wiederholen Sie den Vorgang für die restlichen Deckgläser und lassen Sie sie trocknen, während Sie die restlichen Reagenzien vorbereiten, und verwenden Sie Deckgläser innerhalb von 24 Stunden nach der Beschichtung.
2. Vorbereitung der Kammer
   1. Wischen Sie einen Objektträger mit einem optischen Linsenpapier ab, um große Ablagerungen zu entfernen. Schneiden Sie zwei Stücke doppelseitiges Klebeband mit einer Länge von ca. 2 cm ab.
   2. Legen Sie ein Stück in die Mitte der langen Kante des Objektträgers. Stellen Sie sicher, dass die Kante des Klebebandes mit der Kante der Folie ausgerichtet ist. Legen Sie das zweite Stück Klebeband etwa 2 mm unter das erste Stück Klebeband, so dass beide parallel und ausgerichtet sind. Dadurch entsteht eine Durchflusskammer, die ca. 10 μl Lösung aufnehmen kann (siehe Abbildung 1).
   3. Nehmen Sie eines der mit Nitrozellulose beschichteten Deckgläser aus Teil 1. Kleben Sie das Deckglas vorsichtig so auf das Klebeband, dass die mit Nitrozellulose beschichtete Seite direkt mit dem Band in Berührung kommt (siehe Abbildung 1). Drücken Sie mit einer Pipettenspitze vorsichtig auf die Schnittstelle zwischen Objektträger und Klebeband, um sicherzustellen, dass das Deckglas richtig auf dem Objektträger haftet. Schneide das überschüssige Klebeband, das über den Rand der Rutsche hängt, mit einer Rasierklinge ab.
3. Vorbereitung des Aktins
   1. Herstellung von 20 μM F-Aktin durch Polymerisation von globulärem Aktin (G-Aktin) in Polymerisationspuffer (50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 25 mM MOPS (pH 7,0) bei 4 °C über Nacht.
   2. F-Aktin wird in Motilitätspuffer (20 mM MOPS, 5 mM MgCl₂, 0,1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7,4)) auf 5 μM verdünnt. Markieren Sie mit mindestens 1,2x molaren Überschuss an Rhodamin-Phalloidin. (in Alufolie abgedeckt) mindestens 2 h auf Eis ruhen lassen. Es kann bis zu 1-2 Monate verwendet und auf Eis gelagert werden.
4. Durchführung des Myosin-5a-Gleitaktinfilament-Assays
   HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die Details des Myosin 5a (HMM) Gleittests bereitgestellt.
   1. Bereiten Sie die in Tabelle 1 beschriebenen Lösungen für Myosin 5a vor und halten Sie sie auf Eis.
   2. Fließen Sie 10 μL des Myosins 5a (50-100 nM) durch die Durchflusskammer und warten Sie 1 min.
   3. Fluss in 10 μL des 1 mg/mL BSA in 50 mM MB mit 1 mM DTT ("salzarmer" Puffer). Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male und warten Sie 1 Minute nach der dritten Wäsche. Verwenden Sie die Ecke eines Seidenpapiers oder Filterpapiers, um die Lösung durch den Kanal zu leiten, indem Sie die Ecke des Papiers vorsichtig am Ausgang der Durchflusskammer platzieren.
   4. Waschen Sie mit 10 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
   5. Fließen Sie 10 μl der schwarzen Aktinlösung (5 μM F-Aktin, 1 μM Calmodulin und 1 mM ATP in 50 mM MB mit 1 mM DTT) ein, um "tote Köpfe" zu eliminieren.
      1. Pipettieren Sie die Lösung mit einer 1-ml-Spritze und einer 27-G-Nadel, um die Aktinfilamente zu scheren, bevor Sie die Lösung in die Kammer einführen. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei Mal und warten Sie nach dem dritten Mal 1 Minute. Ungefähr 20 Pipettiervorgänge sind ausreichend.
      2. Um den "Totkopf"-Spin durchzuführen, fügen Sie eine stöchiometrische Menge F-Aktin zu Myosin in Gegenwart von 1 mM ATP und 1 mM MgCl₂ bei einer Salzkonzentration von 500 mM hinzu. Dann ultrazentrifugieren bei 480.000 x g für 15 min bei 4 °C. Das tote Myosin befindet sich im Pellet.
   6. 50 μl 50 mM MB mit 1 mM DTT und 1 mM ATP einfließen lassen, um die Kammer von freien Aktinfilamenten zu erschöpfen.
   7. Waschen Sie mit 10 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male, um die Kammer von jeglichem ATP zu erschöpfen.
   8. 10 μl 20 nM Rhodamin-Aktin-Lösung (Rh-Aktin) mit 1 mM DTT in 50 mM MB einfließen lassen und 1 min warten, um eine strenge Bindung der Aktinfilamente an das Myosin 5a zu ermöglichen, das an der Oberfläche des Deckglases befestigt ist.
   9. Waschen Sie mit 10 μl 50 mM MB mit 1 mM DTT, um Rh-Aktin-Filamente, die nicht an die Oberfläche gebunden sind, wegzuwaschen. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
   10. 30 μl Endpuffer einfließen lassen.
   11. Nehmen Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einer Anregungswellenlänge von 561 nm auf, um Rh-Aktin sichtbar zu machen. Eine geeignete Belichtungszeit beträgt 200 ms bei 1,4 mW Laserleistung für eine Gesamterfassungsdauer von 0,5-1 min.
       HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Erfassungsrate entsprechend der Geschwindigkeit der sich bewegenden Filamente skaliert wird. Eine wichtige Überlegung vor dem Sammeln von Daten für die Verwendung mit Tracking-Programmen ist die Erfassungs-Framerate. Subpixel-Bewegungen zwischen den Frames führen zu einer Überschätzung der Geschwindigkeit, und Bewegungen von mehreren hundert Nanometern sind erforderlich, um genaue Werte zu erhalten. Eine optimale Erfassungsrate zeichnet sich durch ein Gleiten des Aktins für einen Abstand von mindestens einem Pixel zwischen den Bildern aus. Im Falle des TIRF-Mikroskops, das hier für die Bildgebung verwendet wird, entspricht diese Schwelle 130 nm; Daher muss ein Myosin, das voraussichtlich 1 μm/s zurücklegt, mit einer Rate von 5 Bildern/s (0,2 s-Intervall) abgebildet werden, um eine Bewegung von 200 nm zu erreichen, während ein Myosin, das voraussichtlich 10 nm/s zurücklegt, 0,05 Bilder/s (20-s-Intervalle) benötigt. Die Daten können daher in dieser Phase bei Bedarf heruntergerechnet werden.

Tabelle 1: Puffer für den Gleittest

Name des Puffers	Zusammensetzung (M5a)	Zusammensetzung (NM2b)	Verwendete Stufen (M5a/NM2b)	Kommentare
4X Motilitätspuffer (4X MB)	80 mM MOPS, pH 7,2	80 mM MOPS, pH 7,2		Filter vakuumieren und bei 4°C lagern
	20 mM MgCl2	20 mM MgCl2
	0,4 Mio. EGTA	0,4 Mio. EGTA
	pH-Wert 7,4	pH-Wert 7,4
50 mM Salt Motility Buffer (50 mM MB)	25% v/v 4X MB	25% v/v 4X MB		Filter vakuumieren und bei 4°C lagern
	50 mM KCl	50 mM NaCl
	Anheben auf Lautstärke mit dH2O	Anheben auf Lautstärke mit dH2O
500 mM Salt Motilitätspuffer (500 mM MB)	N/A	25% v/v 4X MB		Filter vakuumieren und bei 4°C lagern
		500 mM NaCl
		Anheben auf Lautstärke mit dH2O
Myosin	0,05-0,1 μM Myosin	0,2 μM Myosin	4.2	Bleiben Sie auf Eis.
	1 mM DVB-T	1 mM DVB-T
	Verdünnen in 50 mM MB	Verdünnen in 500 mM MB
1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA)	1 mg/ml BSA	1 mg/ml BSA	4.3	Bleiben Sie auf Eis.
	Verdünnen in 50 mM MB	Verdünnen in 500 mM MB
	1 mM DVB-T	1 mM DVB-T
5 μM Unbeschriftetes F-Aktin in 50 mM MB (schwarzes Aktin)	5 μM unmarkiertes F-Aktin	5 μM unmarkiertes F-Aktin	4.5	Bleiben Sie auf Eis. Scheren Sie das Aktin, indem Sie 5-10 Mal auf und ab pipettieren oder eine Spritze verwenden.
	1 μM Calmodulin (CaM)	1 mM ATP
	1 mM ATP	0,2 mM CaCl2
	Verdünnen in 50 mM MB	1 μM CaM
		1–10 nM Myosin-Leichtkettenkinase (MLCK)
		Verdünnen in 50 mM MB
MB mit 1 mM DTT und 1 mM ATP	1 mM DVB-T	1 mM DVB-T	4.6	Bleiben Sie auf Eis.
	1 mM ATP	1 mM ATP
	Verdünnen in 50 mM MB	Verdünnen in 50 mM MB
MB mit DVB-T	1 mM DVB-T	1 mM DVB-T	4.4, 4.7, 4.9	Bleib auf Eis.
	Verdünnen in 50 mM MB	Verdünnen in 50 mM MB
20 nM Rhodamin-Phalloidin F-Aktin (Rh-Aktin)	20 nM Rhodamin-Phalloidin F-Aktin	20 nM Rhodamin-Phalloidin F-Aktin	4.8	Bleiben Sie auf Eis. Nicht wirbeln.
	1 mM DVB-T	1 mM DVB-T
	Verdünnen in 50 mM MB	Verdünnen in 50 mM MB
Letzter Puffer	50 mM KCl	0,7 % Methylcellulose (optional)	4.10	Fügen Sie die Glukose, die Glukoseoxidase und die Katalase unmittelbar vor der Durchführung des Experiments hinzu. Bleiben Sie auf Eis.
	20 mM MOPS, pH 7,2	50 mM NaCl
	5 mM MgCl2	20 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 Mio. EGTA	5 mM MgCl2
	1 mM ATP	0,1 Mio. EGTA
	50 mM DVB-T	1 mM ATP
	1 μM Calmodulin	50 mM DVB-T
	2,5 mg/ml Glukose	1–10 nM MLCK
	100 μg/ml Glukoseoxidase	0,2 mM CaCl2
	40 μg/ml Katalase	1 μM Calmodulin
		2,5 mg/ml Glukose
		100 μg/ml Glukoseoxidase
		40 μg/ml Katalase

Ergebnisse

Abbildung 1: Vorbereitung funktionalisierter Durchflusszellenkammern. (A) Beginnen Sie mit einem gereinigten Objektträger, zwei auf ca. 2 cm geschnittenem doppelseitigem Klebeband und einem funktionalisierten Deckglas. (B) Bringen Sie das Klebeband in der Mitte des Objektträgers an. (C) Befestigen Sie das Deckglas mit der Beschichtung (z. B. Nitro...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Amylacetat	Ladd Research Branchen	Nr. 10825
Atp	Millipore Sigma	Nr. A7699
Rinderserumalbumin	Millipore Sigma	Artikel-Nr.: 5470
Calmodulin		PMID: 2985564
Katalase	Millipore Sigma	Nr. C40
Zirkuläres Filterpapier - Gleitfähiger Assay	Millipore Sigma	WHA1001125
Deckglas-Gestell	Millipore Sigma	Z688568-1EA
Deckgläser: Gleitend wirkender Filament-Assay	VWR Deutschland	Tel.: 48366-227
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	Nr. D0632
Doppelseitiges Klebeband	Büro Depot	909955
EGTA (EGTA)	Millipore Sigma	Nr. E4378
Ethanol	Fischer Scientific	Nr. A4094
G-Aktin		PMID: 4254541	G-Aktin-Stamm kann bei 200 μM in flüssigem N2 gelagert werden.
Traubenzucker	Millipore Sigma	Nr. G8270
Glukose-Oxidase	Millipore Sigma	Nr. G2133
Kcl	Fischer Scientific	Nr. P217-500
Pipettenspitzen mit großer Öffnung	Fischer Scientific	Tel.: 02-707-134
Methylcellulose	Millipore Sigma	Nr. M0512
Objektträger	Fischer Scientific	Artikel-Nr.: 12-553-10
MOPS	Fischer Scientific	Nr. BP308-100
Nitrozellulose	Ladd Research Branchen	10800
Rasierklingen	Büro Depot	397492
Rhodamin-Phalloidin	ThermoFisher Scientific	Nr. R415	Das Material kann in 100 % Methanol auf eine Endkonzentration von 200 μM verdünnt werden.
Gewebekulturschale - Gleitfähiger Assay	Corning	353025	Jede Gewebekulturschale kann ca. neun Deckgläser aufnehmen.
200 μl Pipettenspitzen mit glatten Seiten	Thomas Wissenschaftlich	Artikel-Nr.: 1158U38
Ausrüstung
Zentrifuge	ThermoFisher Scientific	75006590
Mikroskop	Nikon	Modell: Eclipse Ti mit H-TIRF System mit 100x TIRF Objektiv (N.A. 1.49)
Mikroskop-Kamera	Andor	Modell: iXon DU888 EMCCD-Kamera (1024 x 1024 Sensorformat)
Mikroskop-Klimakontrollbox	Tokai HIT	Kundenspezifische Thermobox
Mikroskop-Lasereinheit	Nikon	LU-n4 Vier-Laser-Einheit mit Festkörperlasern für 405 nm, 488 nm, 561 nm und 640 nm
Optima Max-XP Tisch-Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	393315

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