Invertierter Motilitäts-Assay: Eine In-vitro-Technik zur Visualisierung der Myosinbewegung auf immobilisierten Aktinfilamenten

Zusammenfassung

Quelle: Tripathi, A., et al. Myosin-spezifische Anpassungen von In-vitro-Fluoreszenzmikroskopie-basierten Motilitätsassays. J. Vis. Exp. (2021).

In diesem Video führen wir einen in vitro Motilitätstest durch, um die Aktin-Myosin-Wechselwirkungen zu analysieren. Die Gleitbewegung von Aktinfilamenten auf immobilisierten Myosinmolekülen wird mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht.

Protokoll

1. Protein-Aufreinigung

1. Zelllyse und Proteinextraktion
   1. Bereiten Sie einen 1,5-fachen Extraktionspuffer basierend auf Tabelle 1 vor. Filtern und bei 4 °C lagern.
   2. Beginnen Sie mit dem Auftauen der Zellpellets auf Eis. Während die Pellets auftauen, ergänzen Sie 100 ml Extraktionspuffer mit 1,2 mM Dithiothreitol (DTT), 5 μg/ml Leupeptin, 0,5 μM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und zwei Proteasehemmer-Tabletten. Bleiben Sie auf Eis.
   3. Sobald das Pellet aufgetaut ist, fügen Sie 1 ml des supplementierten Extraktionspuffers pro 10 ml Zellkultur hinzu. Wenn die Zellpellets beispielsweise aus 500 mL Zellkultur gebildet wurden, fügen Sie dem Pellet 50 mL supplementierten Extraktionspuffer hinzu.
   4. Beschallen Sie die Zellpellets, während Sie sie auf Eis halten. Für jedes Pellet sind die folgenden Bedingungen zu verwenden: 5 s EIN, 5 s AUS, Dauer 5 min, Leistung 4-5.
   5. Das gesamte homogenisierte Lysat wird in ein Becherglas gegeben und ATP (0,1 M Stammlösung; pH 7,0) so zugegeben, dass die Endkonzentration von ATP 1 mM beträgt. 15 min in einem kalten Raum rühren. Das ATP dissoziiert aktives Myosin vom Aktin, so dass es im folgenden Zentrifugationsschritt getrennt werden kann. Es ist daher wichtig, sofort mit dem nächsten Schritt fortzufahren, um die Möglichkeit eines ATP-Abbaus und einer erneuten Bindung an Aktin zu minimieren.
   6. Die Lysate werden bei 48.000 x g für 1 h bei 4 °C zentrifugiert. Während dies geschieht, beginnen Sie mit dem Waschen von 1-5 ml einer 50%igen Aufschlämmung Anti-FLAG-Affinitätsharz (für ein Pellet aus 1 l Zellen) mit 100 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Waschen Sie beispielsweise für 5 ml Harz 10 ml einer 50%igen Aufschlämmung. Im letzten Waschschritt resuspendieren Sie das Harz mit 1-5 mL PBS mit genügend Volumen, um eine 50%ige Aufschlämmung zu erzeugen.
   7. Nach der Lysatzentrifugation den Überstand mit der gewaschenen Harzaufschlämmung vermischen und 1-4 h schonend im Kühlraum schaukeln. Während der Wartezeit die in Tabelle 1 beschriebenen Puffer herstellen und auf Eis legen.
2. FLAG Affinitätsreinigungspräparat
   1. Die Lösung wird in Schritt 1.7 bei 500 x g 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Das Harz wird am Boden der Tube verpackt. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Harz zu stören.
   2. Resuspendieren Sie das Harz in 50 mL Puffer A, wie in Tabelle 1 beschrieben, und zentrifugieren Sie es bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Harz zu stören.
   3. Resuspendieren Sie das Harz in 50 mL Puffer B, wie in Tabelle 1 beschrieben, und zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 4 °C bei 500 x g. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal und resuspendieren Sie das Harz in 20 mL Puffer B. Mischen Sie dann das Harz und den Puffer gründlich, indem Sie das Röhrchen etwa 10 Mal vorsichtig von Hand umdrehen.
3. Proteinelution und -konzentration
   1. Stellen Sie 30 ml Elutionspuffer her, wie in Tabelle 1 beschrieben, und lassen Sie ihn auf Eis abkühlen.
   2. Stellen Sie die Elutionssäule in einem kalten Raum auf. Gießen Sie die Harzaufschlämmung vorsichtig in die Säule. Waschen Sie die Säule mit 1-2 Säulenvolumina Puffer B, während sich das Harz auf den Boden packt, um sicherzustellen, dass das Harz nicht austrocknet.
   3. Lassen Sie 1 mL des Elutionspuffers durch das Harz fließen und sammeln Sie den Durchfluss in einem 1,5 mL Röhrchen. Wiederholen Sie den Vorgang, bis 12,1 ml-Fraktionen gesammelt sind.
   4. Führen Sie an dieser Stelle einen groben Bradford-Test an den Fraktionen durch, um qualitativ zu bestimmen, welche Fraktionen am stärksten konzentriert sind. Pipettieren Sie in einer Reihe einer 96-Well-Platte 60 μl 1x Bradford-Reagenz. Mischen Sie beim Sammeln der Fraktionen 20 μl jeder Fraktion pro Vertiefung. Eine dunklere blaue Färbung zeigt die konzentrierteren Fraktionen an.
   5. Sammeln Sie das verbleibende Protein in einem 50-ml-Röhrchen, indem Sie den restlichen Elutionspuffer vorsichtig durch die Säule pipettieren, um das verbleibende Myosin, das an das Harz im Säulendurchfluss gebunden ist, freizusetzen. Dieser Flow-Through wird im nächsten Schritt konzentriert. Stellen Sie sicher, dass das Harz dann für die Wiederverwendung regeneriert und gemäß den Anweisungen des Herstellers gelagert wird.
   6. Bündeln Sie die drei am stärksten konzentrierten Fraktionen und konzentrieren Sie den Durchfluss im 50-ml-Röhrchen sowie die restlichen 1-ml-Fraktionen mit einem 100.000-MWCO-Konzentrationsröhrchen. Laden Sie die gepoolte Probe auf das Konzentrationsröhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 750 x g für 15 min bei 4 °C und wiederholen Sie den Vorgang, bis das gesamte eluierte Protein auf ein Endvolumen von ca. 0,5 bis 1 ml konzentriert ist
      Anmerkung: Diese Porengröße ermöglicht die Retention der Myosinmoleküle, die Massen haben, die ein Vielfaches des Molekulargewichtsgrenzwerts betragen. Die Leichtketten bleiben während dieses Konzentrationszeitraums fest an die motorischen Domänen gebunden, was durch die Durchführung einer SDS-PAGE-Gelelektrophorese am Endprodukt nachgewiesen wurde.
4. Dialyse und Schockfrosten
   1. Stellen Sie 2 l Dialysepuffer her, wie in Tabelle 1 beschrieben. Laden Sie die Probe in einen Dialysebeutel oder eine Dialysekammer und dialysieren Sie sie über Nacht im Kühlraum.
      Anmerkung: Im Fall von M5a-HMM ist das Protein nach der Nachtdialyse ausreichend rein für die Verwendung in nachfolgenden Assays. Bei Bedarf können weitere Reinigungsschritte wie Gelfiltration oder Ionenaustauschchromatographie durchgeführt werden.
5. Rückgewinnung von Myosin nach der Dialyse
   1. Bei M5a-HMM ist die gesamte Probe vorsichtig aus der Dialysekammer zu entnehmen und 15 Minuten lang bei 4 °C bei 49.000 x g zu zentrifugieren, falls unerwünschte Aggregate vorhanden sind. Nimm den Überstand.
6. Konzentrationsbestimmung und Schockfrosten
   1. Um die Konzentration des Produkts zu bestimmen, messen Sie die Extinktion mit einem Spektralphotometer bei den Wellenlängen 260, 280, 290 und 320 nm. Berechnen Sie die Konzentration in mg/ml (c_mg/ml) mit Gleichung 1, wobei A₂₈₀ die Absorption bei 280 nm und A₃₂₀ die Absorption bei 320 nm darstellt. Die resultierende Konzentration in mg/ml kann mit Gleichung 2 in μM von Myosinmolekülen umgerechnet werden, wobei M das Molekulargewicht des gesamten Proteins (einschließlich der schweren Ketten, leichten Ketten, Fluorophore und aller Tags) ist.
      c_mg/ml = (A₂₈₀ - A₃₂₀) / ε (1)
      μM Moleküle = 1000c_mg/mL/M (2)
      Anmerkung: Wenn eine Verdünnung notwendig ist, dann muss diese in einem Puffer mit hoher Ionenstärke erfolgen. Der Extinktionskoeffizient (ε) kann bestimmt werden, indem die Aminosäuresequenz des Proteins in ein Programm wie ExPASy importiert wird. Die typische Ausbeute für das M5a-HMM beträgt etwa 0,5-1 ml 1-5 mg/ml Protein. Der Extinktionskoeffizient für das in dieser Arbeit verwendete M5a-HMM betrug 0,671.
   2. Lagern Sie das gereinigte Myosin auf eine der beiden Arten. Aliquotieren Sie zwischen 10 und 20 μl in ein dünnwandiges Röhrchen, z. B. ein Polymerisationskettenreaktionsröhrchen, und geben Sie das Röhrchen zum Schockfrosten in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff. Alternativ können Sie zwischen 20 und 25 μl Myosin direkt in flüssigen Stickstoff pipettieren und die gefrorenen Proteinkügelchen in sterilen Kryoröhrchen aufbewahren. In beiden Fällen können die resultierenden Röhrchen in -80 °C oder in flüssigem Stickstoff für die zukünftige Verwendung gelagert werden.
      Anmerkung: Da der unten beschriebene Motilitätsassay sehr geringe Mengen an Protein benötigt, ist die Lagerung in kleinen Aliquoten, wie beschrieben, wirtschaftlich.

2. Einzelmolekül-TIRF-Assay

1. Vorbereitung des Deckglases
   1. Das Stammpulver wird in 10 mg Aliquots (in 1,5 mL Röhrchen) Methoxy-Peg-Silan (mPEG) und 10 mg Aliquots Biotin-Peg-Silan (bPEG) aufgeteilt. Bei -20 °C in einem verschlossenen, feuchtigkeitsfreien Behälter lagern und innerhalb von 6 Monaten verbrauchen.
   2. Legen Sie acht quadratische Deckgläser mit einer Dicke von 22 mm Nr. 1,5 H (hohe Präzision) auf ein Gestell und waschen Sie es mit 2-5 ml 200-prozentigem Ethanol, gefolgt von 2-5 ml destilliertem Wasser. Wiederholen Sie diesen Waschschritt und beenden Sie ihn mit Wasser. Anschließend die Deckgläser mit einer Luftleitung oder N₂ vollständig trocknen und 3 min lang mit Argon plasmareinigen.
   3. Legen Sie die sauberen Deckgläser auf Filterpapier (90 mm) in eine Gewebekulturschale (100 x 20 mm) und inkubieren Sie sie in einem 70 °C heißen Ofen, während Sie die folgenden Schritte durchführen
      HINWEIS: Die Plasmareinigung kann durch andere chemische Reinigungsmethoden ersetzt werden.
   4. Bereiten Sie eine 80%ige Ethanollösung mit dH₂O vor und stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 2,0 ein. Geben Sie 1 ml davon zu einem 10 mg Aliquot von mPEG und 1 ml zu einem 10 mg Aliquot von bPEG. Wirbel zum Auflösen, was nicht länger als 30 s dauern sollte.
   5. Nehmen Sie 100 μl der bPEG-Lösung und fügen Sie 900 μl 80%iges Ethanol (pH 2,0) hinzu. Diese Lösung ist 1 mg/ml bPEG. Stellen Sie dann eine Lösung aus beiden PEGs wie folgt her und mischen Sie sie gründlich.
      1. 200 μl 10 mg/mL mPEG (Endkonzentration: 2 mg/mL).
      2. 10 μl des 1 mg/ml bPEG (Endkonzentration: 10 μg/ml).
      3. 790 μl der 80%igen Ethanollösung (pH 2,0).
   6. Nehmen Sie die Deckgläser aus dem Ofen. Geben Sie vorsichtig 100 μl der PEG-Lösung auf die Mitte jedes Deckglases und stellen Sie sicher, dass nur die Oberseite nass ist. Dann die Slips wieder in den Ofen schieben und 20 bis 30 Minuten inkubieren.
   7. Wenn die Deckgläser anfangen, löchrig auszusehen und kleine Kreise auf der Oberfläche zu erkennen, nehmen Sie sie aus dem Ofen.
   8. Waschen Sie jeden Deckbezug mit 100 % Ethanol, trocknen Sie ihn mit einem Luftschlauch und stellen Sie ihn wieder in den Ofen. Inkubieren Sie nur so lange, wie es zum Erstellen von Kammern in Schritt 2 erforderlich ist.
2. Vorbereitung der Kammer
   1. Reinigen Sie einen Objektträger, der für die Herstellung der Kammer verwendet werden soll. Schneiden Sie zwei Stücke doppelseitiges Klebeband mit einer Länge von ca. 2 cm ab.
   2. Legen Sie ein Stück in die Mitte der langen Kante des Objektträgers. Stellen Sie sicher, dass die Kante des Klebebandes mit der Kante der Folie ausgerichtet ist. Legen Sie das zweite Stück Klebeband etwa 2 mm unter das erste Stück Klebeband, so dass beide parallel und ausgerichtet sind.
   3. Nehmen Sie eines der funktionalisierten Deckgläser aus dem Ofen (erstellt in 2.1). Kleben Sie das Deckglas vorsichtig so auf das Klebeband, dass die mit PEG beschichtete Seite nach unten zeigt und direkten Kontakt mit dem Klebeband hat, wie in Abbildung 1 gezeigt. Drücken Sie mit einer Pipettenspitze vorsichtig auf die Schnittstelle zwischen Objektträger und Klebeband, um sicherzustellen, dass das Deckglas richtig auf dem Objektträger haftet.
   4. Schneide das überschüssige Klebeband, das über der Rutsche hängt, mit einer Rasierklinge ab. Diese Kammern können sofort verwendet oder paarweise in ein 50-ml-Röhrchen gegeben und für die zukünftige Verwendung in einem -80 °C-Gefrierschrank gelagert werden. Es ist wichtig, es sofort zu lagern, da sich die Oberfläche sonst verschlechtert.
3. Durchführung des Myosin 5a TIRF-Mikroskopie-Assays
   1. Bereiten Sie die Lösungen für den in Tabelle 2 beschriebenen Myosin-5a-Motilitätstest vor und bewahren Sie sie auf Eis auf.
   2. Waschen Sie die Kammer mit 10 μl 50 mM MB mit 1 mM DTT.
   3. Fluss in 10 μL des 1 mg/mL BSA in 50 mM MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male und warten Sie 1 Minute nach der dritten Wäsche. Verwende die Ecke eines Seidenpapiers oder Filterpapiers, um die Lösung durch den Kanal zu leiten.
   4. Waschen Sie mit 10 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
   5. 10 μl der NeutrAvidin-Lösung in 50 mM MB mit 1 mM DTT einfließen lassen und 1 min warten.
   6. Waschen Sie mit 10 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
   7. 10 μl biotinyliertes Rhodamin-Aktin (bRh-Aktin) mit 1 mM DTT in 50 mM MB einfließen lassen und 1 min warten. Verwenden Sie für diesen Schritt eine Pipettenspitze mit großer Bohrung und vermeiden Sie das Auf- und Abpipettieren, um das Scheren der fluoreszierenden Aktinfilamente zu minimieren und sicherzustellen, dass lange Aktinfilamente an der Oberfläche befestigt werden können (20-30 μm oder länger). Eine effektive Alternative ist das Schneiden des Konus einer Standard-Pipettenspitze (mit einer Öffnung von ≈1-1,5 mm).
   8. Waschen Sie mit 10 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
   9. 30 μl Final Buffer mit 10 nM Myosin 5a zugeben, dann sofort auf das TIRF-Mikroskop laden und aufzeichnen, nachdem der optimale Fokus für die TIRF-Bildgebungsmodalität gefunden wurde. Belichtungszeiten zwischen 100-200 ms sind bei 1,4 mW Laserleistung für das Aktin- und GFP-markierte Myosin geeignet. Eine geeignete Erfassungszeit für die Geschwindigkeitsanalyse beträgt 3 min.

Tabelle 1: Puffer, die bei der Proteinreinigung verwendet werden.

Name des Puffers	Zusammensetzung	Verwendete Schritte	Kommentare
M5a Extraktionspuffer	0,3 M NaCl	1.1	Auf Eis bleiben.
	15 mM MOPS, pH 7,2
	15 mM MgCl2
	1,5 Mio. EGTA
	4,5 mM NaN3
Puffer A	0,5 M NaCl	2.2	Bleiben Sie auf Eis.
	10 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 Mio. EGTA
	3 mM NaN3
	1 mM ATP
	1 mM DVB-T
	5 mM MgCl2
Puffer B	0,5 M NaCl	2.3	Auf Eis bleiben.
	10 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 Mio. EGTA
	3 mM NaN3
	1 mM DVB-T
Elutionspuffer	0,5 M NaCl	3.1	Bleiben Sie auf Eis.
	0,5 mg/ml FLAG-Peptid
	10 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 Mio. EGTA
	3 mM NaN3
	pH-Wert 7,2
M5a Dialyse-Puffer	500 mM KCl	4.1	Verwenden Sie kaltes dH2O, um es auf Lautstärke zu bringen.
	10 mM MgCl2
	10 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 Mio. EGTA
	1 mM DVB-T

Tabelle 2: Puffer, die im TIRF-Assay verwendet werden.

Name des Puffers	Zusammensetzung	Verwendete Schritte	Kommentare
4X Motilitätspuffer (4X MB)	80 mM MOPS, pH 7,2		Filter vakuumieren und bei 4°C lagern
	20 mM MgCl2
	0,4 Mio. EGTA
	pH-Wert 7,4
50 mM Salt Motilitätspuffer (50 mM MB)	25% v/v 4X MB		Filter vakuumieren und bei 4°C lagern
	50 mM KCl
	Anhebung auf Lautstärke mit dH2O
150 mM Salz-Motilitätspuffer (150 mM MB)			Vakuumfilter und Lagerung bei 4°C
Myosin		Siehe "Final Buffer" Rezept	Bleiben Sie auf Eis.
2 mg/ml NeutrAvidin	2 mg/ml NeutrAvidin	3.5	Bleiben Sie auf Eis.
	1 mM DVB-T
	Verdünnen in 50 mM MB
1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA)	1 mg/ml BSA	3.3	Bleiben Sie auf Eis.
	1 mM DVB-T
	Verdünnen in 50 mM MB
>200 nM Rhodamin-Phalloidin, biotinyliertes F-Aktin (bRh-Aktin)	200 nM Rhodamin-Phalloidin, biotinyliertes F-Aktin	3.7	Vermeiden Sie Scherungen, indem Sie nicht vortexen oder auf und ab pipettieren. Zum Mischen vorsichtig invertieren.
	1 mM DVB-T
	Verdünnen in 50 mM MB
MB mit DVB-T	50 mM DVB-T	3.2, 3.4, 3.6, 3.8	Bleib auf Eis.
	Verdünnen in 50 mM MB
Endpuffer	50 mM KCl	3,9	Fügen Sie die Glukose, die Glukoseoxidase und die Katalase unmittelbar vor der Durchführung des Experiments hinzu. Bleiben Sie auf Eis.
	20 mM MOPS, pH 7,2
	5 mM MgCl2
	0,1 Mio. EGTA
	1 mM ATP
	50 mM DVB-T
	1 μM Calmodulin
	2,5 mg/ml Glukose
	100 μg/ml Glukoseoxidase
	40 μg/ml Katalase
	10 nM Myosin

Ergebnisse

Abbildung 1: Vorbereitung funktionalisierter Durchflusszellenkammern.(A) Beginnen Sie mit einem gereinigten Objektträger, zwei auf ca. 2 cm geschnittenem doppelseitigem Klebeband und einem funktionalisierten Deckglas. (B) Bringen Sie das Klebeband in der Mitte des Objektträgers an. (C) Befestigen Sie das Deckglas mit der Beschichtung nach unten am...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2 M MgCl2 Lösung	VWR	Tel.: 10128-298
5 M NaCl-Lösung	KD Medizin	RGE-3270
Essigsäure	ThermoFisher Scientific	984303
Anti-FLAG M2 Affinity Gel	Millipore Sigma	Nr. A2220	https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
Atp	Millipore Sigma	Nr. A7699
Biotinyliertes G-Aktin	Zytoskelett, Inc.	AB07
Rinderserumalbumin	Millipore Sigma	Artikel-Nr.: 5470
bPEG-Silan	Laysan Bio, Inc	Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagenz-Konzentrat	Bio-Rad	5000006
Calmodulin		PMID: 2985564
Katalase	Millipore Sigma	Nr. C40
Zelllinie (Sf9) in SF-900 II SFM	ThermoFisher Scientific	11496015	http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Zirkuläres Filterpapier - Invertierter Assay	Millipore Sigma	WHA1001090
Vollständige, EDTA-freie Proteasehemmer Tabletten	Millipore Sigma	5056489001	Diese sollte bei 4 °C gelagert werden. Die Tabletten können direkt verwendet oder als 25-fache Stammlösung rekonstituiert werden, indem 1 Tablette in 2 mL destilliertem Wasser aufgelöst wird. Die resultierende Lösung kann 1-2 Wochen oder mindestens 12 Wochen bei -20 °C bei 4 °C gelagert werden.
Konzentrationsrohre (100.000 MWCO)	EMD Millipore Gesellschaft	UFC910024	Die MWCO des Röhrchens ist nicht unbedingt eine Einheitsgröße, solange die MWCO kleiner ist als das Gesamtmolekulargewicht des zu reinigenden Proteins. Die M5a wurde mit einer 30.000 MWCO-Röhre konzentriert.
Coomassie Brillantblau R-250 Farbstoff	ThermoFisher Scientific	20278
Deckglas-Gestell	Millipore Sigma	Z688568-1EA
Deckgläser: Invertierter Motilitätstest	Azer Scientific	ES0107052
Dialyseschlauch (3500 Dalton MCWO)	Fischer Scientific	08-670-5A	Der Durchmesser des Dialyseschlauchs kann variieren, aber der MWCO sollte gleich sein. Die Röhrchen können in einer 20%igen Alkohollösung bei 4 °C gelagert werden.
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	Nr. D0632
Doppelseitiges Klebeband	Büro Depot	909955
DYKDDDDK Peptid	GenScript	RP10586	Dieses kann in einem Puffer gelöst werden, der 0,1 M NaCl, 0,1 mM EGTA, 3 mM NaN3 und 10 mM MOPS (pH 7,2) bis zu einer Endkonzentration von 50 mg/ml enthält. Diese können bei -20 °C als 300 μL Aliquote gelagert werden.
EGTA (EGTA)	Millipore Sigma	Nr. E4378
Elutions-Säule	Bio-Rad	Nr. 761-1550	Diese können wiederverwendet werden. Spülen Sie die Säule zum Reinigen mit 2-3 Säulenvolumina PBS und destilliertem Wasser. Die Säule vor Gebrauch bei 4° C kühlen.
Ethanol	Fischer Scientific	Nr. A4094
Traubenzucker	Millipore Sigma	Nr. G8270
Glukose-Oxidase	Millipore Sigma	Nr. G2133
Glycin-Pufferlösung, 100 mM, pH 2-2,5, 1 L	Santa Cruz Biotechnologie	SC-295018
hcl	Millipore Sigma	320331
Kcl	Fischer Scientific	Nr. P217-500
Pipettenspitzen mit großer Öffnung	Fischer Scientific	Tel.: 02-707-134
Leupeptin-Protease-Hemmer	ThermoFisher Scientific	Artikel-Nr.: 78435
Mark12 Ungefärbte Standardleiter	ThermoFisher Scientific	Nr. LC5677
Methanol	Millipore Sigma	MX0482
Objektträger	Fischer Scientific	Artikel-Nr.: 12-553-10
MOPS	Fischer Scientific	Nr. BP308-100
mPEG-Silan	Laysan Bio, Inc	MPEG-SIL-2000-1g
NaN3	Millipore Sigma	Nr. S8032
NeutrAvidin	ThermoFisher Scientific	Artikel-Nr.: 31050
NuPAGE 4 bis 12 % Bis-Tris Mini-Protein-Gel, 15 Wells	ThermoFisher Scientific	NP0323PK2
NuPAGE LDS-Probenpuffer (4-fach)	ThermoFisher Scientific	Nr. NP0007
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4	ThermoFisher Scientific	10010023
PMSF (Englisch)	Millipore Sigma	Artikel-Nr.: 78830	PMSF kann als 0,1 M Stammlösung in Isopropanol hergestellt und in 4 °C gelagert werden. Durch die Zugabe von Isopropanol entsteht eine Kristallfällung, die durch Rühren bei Raumtemperatur aufgelöst werden kann. Unmittelbar vor der Verwendung kann PMSF tropfenweise zu einer schnell rührenden Lösung bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mM hinzugefügt werden.
Rasierklingen	Büro Depot	397492
Rhodamin-Phalloidin	ThermoFisher Scientific	Nr. R415	Das Material kann in 100 % Methanol auf eine Endkonzentration von 200 μM verdünnt werden.
Sf9 Medien	ThermoFisher Scientific	Tel.: 12658-027	Dieser sollte bei 4° C gelagert werden. Die Haltbarkeit beträgt 18 Monate ab Herstellungsdatum.
Gewebekulturschale - Invertierter Assay	Corning	353003	Jede Gewebekulturschale kann ca. vier Deckgläser aufnehmen.
200 μl Pipettenspitzen mit glatten Seiten	Thomas Wissenschaftlich	Artikel-Nr.: 1158U38
Ausrüstung
Zentrifuge	ThermoFisher Scientific	75006590
Mikroskop	Nikon	Modell: Eclipse Ti mit H-TIRF System mit 100x TIRF Objektiv (N.A. 1.49)
Mikroskop-Kamera	Andor	Modell: iXon DU888 EMCCD-Kamera (1024 x 1024 Sensorformat)
Mikroskop-Klimakontrollbox	Tokai HIT	Kundenspezifische Thermobox
Mikroskop-Lasereinheit	Nikon	LU-n4 Vier-Laser-Einheit mit Festkörperlasern für 405 nm, 488 nm, 561 nm und 640 nm
Mittelbank-Zentrifuge	ThermoFisher Scientific	Modell: CR3i
Misonix Ultraschallgerät	Misonix	XL2020
Optima Max-XP Tisch-Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	393315
Plasma-Reiniger	Diener electronic GmbH + Co. KG	Systemtyp: Zepto
Ultraschall-Sonde (3,2 mm)	Qsonica	Nr. 4418
Standard-Inkubator	Bindemittel	Modell: 56
Waverly Röhrenmischer	Waverly	TR6E