$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft
1. Passive Sensibilisierung von huRBL-Zellen
- Die vorinkubierte Ag8/Serum-Suspension wird 5 Minuten lang bei 250 x g zentrifugiert.
- Übertragen Sie 50 μl der zentrifugierten Ag8/Serumsuspension in jede Vertiefung mit huRBL-Zellen, ohne das Ag8-Zellpellet zu stören.
- Dazu gehören die No-Antigen-Kontrolle, bei der es sich um sensibilisierte, aber nicht stimulierte Zellen handelt (kein Antigen hinzufügen), die als Indikation für das untere Signalplateau/den Hintergrund dienen. Hintergrund- und maximale Lysekontrollwells müssen nicht mit Serum sensibilisiert werden. Fügen Sie stattdessen 50 μl huRBL-Medium hinzu, um die Vertiefungen zu kontrollieren.
- Decken Sie die Platte mit dem Deckel ab und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C und 5%-7% CO2.
2. Antigen-stimulierte Degranulation und Mediatorfreisetzung
- Bereiten Sie die Antigenverdünnung in 1x Tyrode-Puffer (9,5 g/l Tyrodesalze, 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA), 0,5 g/l Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) in dH2O) im Voraus vor. Es wird eine Endmenge von 100 μl pro Vertiefung benötigt.
Anmerkung: Nicht jedes Allergen, sei es aus natürlichen Quellen gereinigt oder rekombinant hergestellt, kann in 1x Tyrode-Puffer stabil sein. Führen Sie daher vor dem Assay-Verfahren Stabilitätstests in 1x Tyrode-Puffer durch. Alternativ können Sie 1x Tyrode-Puffer in Deuteriumoxid (D2O) verdünnen, um das Signal-Rausch-Verhältnis des Assays zu erhöhen.
- Es werden 8 Verdünnungen des interessierenden Antigens einer Verdünnungsreihe von 1:10 in Reaktionsgefäßen vorgenommen, beginnend mit entweder 10 oder 1 μg/ml Protein.
HINWEIS: Testen Sie die Verdünnungsreihe immer vorher. Alternativ können Sie die 1:10-Verdünnungsreihe (z. B. 1:5, 1:20 oder 1:30) anpassen, um die gesamte Freisetzungskurve abzudecken. Zudem kann die Ausgangskonzentration je nach Versuchsaufbau variieren.
- Um huRBL-Zellen zu waschen, die auf der 96-Well-Platte plattiert sind, entfernen Sie zuerst das serenhaltige Zellmedium, indem Sie die Platte vorsichtig ansaugen, umkehren und auf saugfähiges Papier klopfen.
- Waschen Sie die Zellen mit 200 μl 1x Tyrodes-Puffer pro Well. Behandeln Sie alle Brunnen gleich.
Anmerkung: Geben Sie die Waschlösung langsam in die Zellen, um sie nicht zu stören.
- Lassen Sie es ca. 30 s einwirken und wiederholen Sie den Waschschritt insgesamt dreimal.
- Nachdem Sie die Waschlösung zum letzten Mal hinzugefügt haben, lassen Sie die Lösung in den Vertiefungen, bis Sie mit der Zugabe der Antigenverdünnung fortfahren können.
Anmerkung: Vermeiden Sie es, die Zellen zu lange der Luft auszusetzen.
- Übertragen Sie 100 μl Antigenlösung in jede Vertiefung, die die vorsensibilisierten huRBL-Zellen enthält.
HINWEIS: Bei der Analyse mehrerer unterschiedlicher Parameter überführen Sie die einzelnen Proben der Verdünnungsreihe in eine zusätzliche unverbindliche 96-Well-Platte (verwenden Sie das gleiche Layout wie auf der huRBL-Platte) und übertragen Sie sie anschließend mit einer Mehrkanalpipette direkt auf die huRBL-Zellplatte. Auf diese Weise kann vermieden werden, dass die Zellen zu lange der Luft ausgesetzt werden, was zu einer schlechten Assay-Leistung (niedrigeres/kein Signal) führen kann.
- Decken Sie die Kontrollvertiefungen (maximale Lyse und nicht sensibilisierte Hintergrundzellen) mit 100 μl 1x Tyrode-Puffer ab. Stimulieren Sie diese Kontrollvertiefungen nicht mit dem Antigen.
- Zusätzlich wird 100 μL 1x Tyrode-Puffer in die sensibilisierten No-Antigen-Wells der Verdünnungsreihe gegeben, was benötigt wird, um die antigenunabhängige spontane Freisetzung sensibilisierter Zellen bei der Datenanalyse zu berücksichtigen.
- Inkubieren Sie huRBL-Zellen für 1 h bei 37 °C und 5%-7% CO2.
3. Fluoreszenzmessung der β-Hexosaminidase-Aktivität
- Behandeln Sie die Vertiefungen der maximalen Lysekontrolle mit 10 μl 10 % Triton X-100 pro Vertiefung und mischen Sie sie richtig, um die Zellen vollständig zu lysieren und die 100%ige Freisetzung von β-Hexosaminidase zu erhalten.
- Geben Sie 50 μl Substratlösung in eine neue, unverbindliche 96-Well-Platte. Substratlösung für eine 96-Well-Platte: 5 ml 0,1 M Zitronen-Assay-Puffer, pH 4,5; und 80 μl 10 mM 4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminid.
- 50 μl des Zellüberstands aller Vertiefungen werden auf die neue Platte mit der Substratlösung übertragen.
HINWEIS: Pipettieren Sie den Überstand vorsichtig von der huRBL-Platte, um die huRBL-Zellen nicht zu stören.
- Die Platte wird 1 h lang bei 37 °C mit Substratlösung und Zellüberstand inkubiert, um die Umwandlung des fluorogenen Substrats zu ermöglichen.
Anmerkung: Bewahren Sie die huRBL-Platte für den Zellviabilitätsassay auf.
- Pro Vertiefung werden 100 μl Stopplösung (15 g/l Glycin, 11,7 g/l NaCl, gelöst in dH2O, pH 10,7) zugegeben.
- Messen Sie die Fluoreszenz bei 360 nm Anregung und 465 nm Emission mit einem Plattenreader.