Humanisierter Mediator-Enzym-Freisetzungsassay: Eine immunchemische Methode zum Screening des allergischen Potenzials von Testantigenen durch Überwachung der Basophilen-Degranulationsreaktion in vitro

Abstract

Quelle: Wenger, M. et al. Humanisierter Mediator Release Assay als Auslesung für die Allergenpotenz. J. Vis. Exp. (2021)

In diesem Video beschreiben wir eine in vitro Methode, um das allergische Potenzial eines Antigens zur Induktion der basophilen Degranulation zu bewerten. β-Hexosaminidase wird als Index für die Freisetzung chemischer Mediatoren verwendet, und die Enzymaktivität von β-Hexosaminidase wird mit einem fluorogenen Substrat gemessen.

Protocol

Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft

1. Passive Sensibilisierung von huRBL-Zellen

1. Die vorinkubierte Ag8/Serum-Suspension wird 5 Minuten lang bei 250 x g zentrifugiert.
2. Übertragen Sie 50 μl der zentrifugierten Ag8/Serumsuspension in jede Vertiefung mit huRBL-Zellen, ohne das Ag8-Zellpellet zu stören.
   1. Dazu gehören die No-Antigen-Kontrolle, bei der es sich um sensibilisierte, aber nicht stimulier....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminid	Sigma	Nr. M2133
96-Well-Platte für huRBL-Zellen (Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Deltatreated, Mikrotiterplatte mit flachem Boden)	ThermoFisher Scientific	167008
96-Well-Platte für Substratlösung und Zellüberstand (Greiner BioOne unbehandelte 96-Well-Mikrotiterplatten)	Fisher Scientific	655101
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma	10735078001
Zitronensäure	Applichem	131018
Glycin	Applichem	Nr. A3707
Natriumchlorid (NaCl)	Applichem	Nr. A2942
Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3)	Applichem	131638
Triton X-100	Sigma	X100
Tyrodes Salz	Sigma	Nr. T2145