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1. Wachstumshemmung Hochdurchsatz-Screening (HTS)
HINWEIS: Die wachstumshemmende Wirkung von Antikrebsmitteln gegen patienteneigene Tumororganoide (PDOs) wird durch Messung des intrazellulären ATP-Gehalts bewertet, wie in Abbildung 1 gezeigt. Dieser Schritt wird mit einem kommerziell erhältlichen Zellviabilitäts-Assay-Kit durchgeführt (siehe Materialtabelle).
- An Tag 0 werden die PDOs (z. B. RLUN007) in Kolben kultiviert, bis eine ausreichende Anzahl von Zellclustern für den Assay zur Verfügung steht. Einen Tag vor der Aussaat die PDO-Suspension aus einem 75-cm-2-Kolben in ein 15-ml-Röhrchen umfüllen und 2 Minuten lang bei 200 x g zentrifugieren, um das PDO-Pelletvolumen zu messen. Anschließend wird das PDO-Pellet in 15 ml frischem Medium resuspendiert und wieder in einen 75 cm2 Kolben überführt. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5 % CO2,
Anmerkung: Das erforderliche PDO-Pelletvolumen hängt von der Verdünnungsrate jedes PDO und der Anzahl der für den Assay verwendeten 384-Well-Platten ab. Für RLUN007 ist ein Volumen von 200 μl Zellpellets erforderlich, um es in zehn 384-Well-Platten zu säen.
- Am Tag 1 (24 h nach dem Wechsel des Mediums) werden die PDOs mit Hilfe von Zellfragmentierungs- und Dispergiergeräten (siehe Materialtabelle) mit einem Filterhalter mit einem 70-μm-Maschenfilter zerkleinert. Verdünnen Sie dann 15 mL der PDO-Suspension um das 10-fache. 40 μl der PDO-Suspension mit einem Zellsuspensionsdispenser (siehe Materialtabelle) in 384-Well-Mikrotiterplatten mit extrem geringer Bindung (mit rundem Boden) aussäen (siehe Materialtabelle).
Anmerkung: Für die Zerkleinerung von Zellclustern wird empfohlen, die kommerziell erhältlichen Zellfragmentierungs- und Dispergiergeräte zu verwenden (siehe Materialtabelle).
- 24 Stunden nach der Aussaat (Tag 2) sind die PDOs mit 0,04 μl Testmittellösungen in Endkonzentrationsbereichen von 20 μM bis 1,0 nM (10 serielle Verdünnungen) unter Verwendung eines Liquid Handlers zu behandeln (siehe Materialtabelle).
- An Tag 8 (144 h nach der Behandlung mit der Testsubstanz) wird das intrazelluläre ATP-Messreagenz in die Testvertiefungen gegeben. Die Platten mit einem Mischer mischen und 10 min bei 25 °C inkubieren. Messen Sie den intrazellulären ATP-Gehalt als Lumineszenz mit einem Plattenlesegerät (siehe Materialtabelle).
- Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu berechnen, dividiert man die Menge an ATP in den Testvertiefungen durch die Menge an ATP in den Kontrollvertiefungen, die das Vehikel enthalten, wobei der Hintergrund abgezogen wird. Um die Wachstumsrate über 6 Tage zu berechnen, dividieren Sie die Menge an ATP in den Vehikel-Kontroll-Wells durch die Menge in den Vehikel-Kontroll-Wells 24 h nach der Aussaat.
- Berechnen Sie die 50%ige Hemmkonzentration (IC50) und die Fläche unter der Kurve (AUC) aus den Dosis-Wirkungs-Kurven mit Hilfe einer biologischen Datenanalysesoftware (siehe Materialtabelle). Der Z-Faktor ist ein dimensionsloser Parameter, der von 1 (unendlicher Abstand) bis <0 reicht, definiert als Z = 1 - (3σc+ + 3σc-) / |μc+ - μc-|, wobei σc+, σc-, μc+ und μc- die Standardabweichungen (σ) und Mittelwerte (μ) der hohen (c+) und niedrigen (c-) Regler sind. beziehungsweise.
