Differentielle radiale Kapillarwirkung des Liganden-Assays: Eine Hochdurchsatztechnik zur Identifizierung von bakteriellen Nukleotid-Second-Messenger-bindenden intrazellulären Proteinen

Zusammenfassung

Quelle: Schicketanz, M. L., et al. Identifizierung der Bindungsproteine kleiner Liganden mit dem Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA). J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video zeigt die differentielle radiale Kapillarwirkung des Ligandenassays — eine Technik zum systematischen Hochdurchsatz-Screening von intrazellulären Nukleotid-Second-Messenger-bindenden Proteinen. Diese Technik ermöglicht eine direkte Bindung der Botenstoffe an das überexprimierte Zielprotein im Zelllysat – unter Umgehung der Notwendigkeit einer Proteinreinigung.

Protokoll

1. Herstellung von Ganzzelllysaten

1. Die E. coli K-12 ASKA ORFeome-Sammelstämme in 1,5 ml Lysogenie-Bouillon (LB) mit 25 μg/ml Chloramphenicol in 96-Well-Deep-Well-Platten impfen. Anbau über Nacht (O/N) für 18 Stunden bei 30 °C und Schütteln bei 160 U/min. Am nächsten Tag geben Sie Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) (final 0,5 mM) in die O/N-Kulturen, um die Proteinexpression bei 30 °C für 6 h zu induzieren.
2. Pelletzellen bei 500 x g für 10 min. Die Pellets bis zur Verwendung bei -80 °C einfrieren. Um die Zellen zu lysieren, fügen Sie 150 μl Lysepuffer L1 (40 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, ergänzt mit 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 40 μg/mL DNase 1 und 0,5 mg/ml Lysozym) hinzu, um das Pellet zu resuspendieren.
3. Frieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei -80 °C ein und tauen Sie sie dann 20 Minuten lang bei 37 °C auf. Wiederholen Sie diesen Zyklus dreimal, um die Zellen zu lysieren. Lagern Sie die Lysate vor Gebrauch bei -80 °C.

2. Reinigung von Rel_seq und GppA

HINWEIS: Die rekombinanten Proteine Rel_seq von Streptococcus equisimilis und GppA von E. coli K-12 werden zur Synthese des radioaktiv markierten pppGpp bzw. ppGpp verwendet.

1. Züchten und sammeln Sie Zellen, die jedes Protein überexprimieren.
   1. Züchten Sie den E. coli BL21 DE3-Stamm bis zur exponentiellen Phase (optische Dichte (OD) ~0,3-0,4) in LB-Brühe und schleudern Sie 1 ml Kultur bei 6000 x g für 5 min. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit 100 μl eiskalter TSB-Bouillon (LB-Bouillon ergänzt mit 0,1 g/ml PEG3350, 0,05 ml/ml Dimethylsulfoxid, 20 mM MgCl₂).
   2. Mischen Sie die Plasmide mit dem Histidin-markierten relseq und gppA, jeweils 100 ng, mit den oben genannten Zellsuspensionen in TSB und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang auf Eis. Die Zellen werden 40 s lang bei 42 °C geschockt. Die Mischung wird 2 Minuten lang auf Eis gelegt und 1 ml LB-Brühe bei Raumtemperatur hinzugefügt, damit sich die Zellen 1 h lang bei 37 °C und unter Rühren bei 160 U/min erholen können.
   3. Die gewonnenen Zellen werden auf LB-Agarplatten plattiert, die mit den entsprechenden Antibiotika (Rel_seq:100 μg/mL Ampicillin; GppA: 30 μg/ml Kanamycin). Am nächsten Tag werden die Völker in LB-Bouillon geimpft, um die O/N-Vorkulturen beider Stämme bei 37 °C zu beginnen.
   4. Nach 18 h beimpfen Sie 500 mL LB-Medium mit 10 mL der O/N-Kulturen und den entsprechenden Antibiotika. Züchten Sie die Kulturen durch Schütteln bei 160 U/min bei 37 °C. Wenn der OD_{600 nm} 0,5-0,7 erreicht, induzieren Sie die Proteinexpression durch Zugabe von 0,5 mM IPTG und wachsen Sie 3 Stunden lang bei 30 °C mit Schütteln bei 160 U/min.
   5. Die Zellen werden durch Schleudern bei 6084 x g für 10 min bei 4 °C gesammelt. Das Pellet wird in 20 ml eiskalter 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert und bei 1912 x g für 20 min bei 4 °C erneut zentrifugiert. Den Überstand dekantieren und die Pellets vor der Verwendung bei -20 °C einfrieren.
2. Nickel-Nitriotriessigsäure (Ni-NTA) Affinitätsreinigung
   Anmerkung: Achten Sie ab diesem Zeitpunkt darauf, dass die Proben kalt sind.
   1. Fügen Sie 40 mL eiskalten Lysepuffer L2 (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% Glycerin, 10 mM Imidazol, 10 mM β-Mercaptoethanol, ergänzt mit Proteaseinhibitoren (EDTA-freie Tablette; siehe Materialtabelle) hinzu, um das Pellet zu resuspendieren. Lysieren Sie die Zellen durch Beschallung (60% Amplitude, 2 s EIN / 4 s AUS für 8 min EIN). Reinigen Sie das Lysat, indem Sie es 40 Minuten lang bei 4 °C bei 23.426 x g schleudern und zur Reinigung mit dem Überstand fortfahren.
   2. Bereiten Sie während der obigen Zentrifugation das Ni-NTA-Harz vor.
      1. Übertragen Sie 500 μl homogenisiertes Ni-NTA-Harz in eine stehende Polypropylen-Chromatographiesäule und lassen Sie es 15 Minuten lang absetzen, bis die Lagerlösung durchgelassen wird. Waschen Sie das Harz zweimal mit 15 mL Reinstwasser und waschen Sie dann die Säule mit 15 mL des Lysepuffers L2.
   3. Laden Sie den gereinigten Überstand des Zelllysats aus Schritt 1 auf die Säule und lassen Sie ihn durchströmen. Waschen Sie die Säule mit 30 mL Waschpuffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% Glycerin, 20 mM Imidazol).
   4. Eluieren Sie die Proteine dreimal mit 400 μl des Elutionspuffers (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% Glycerin, 500 mM Imidazol). Wiederholen Sie dann die Elution mit weiteren 300 μl des Elutionspuffers. Kombinieren Sie die eluierten Proteine zu einem Endvolumen von 700 μl.
3. Gel-Filtration
   1. Bereiten Sie einen Gelfiltrationspuffer vor (50 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl; 5% Glycerin). Waschen Sie die Größenausschlusssäule mit einem Säulenvolumen (25 ml) des Gelfiltrationspuffers.
   2. Laden Sie die obige 700-μl-Probe mit einer 500-μl-Schleife, führen Sie sie mit 0,5 mL/min durch und sammeln Sie 2-3 Fraktionen mit jeweils 0,5 mL Volumen, die die entsprechenden Proteine enthalten.
   3. Kombinieren und konzentrieren Sie die Fraktionen, die jedes der Proteine enthalten, mit einer Spin-Säule und messen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay.

3. Synthese von ³²P-markierten pppGpp und ppGpp

1. Assemblieren Sie eine kleinskalige Rel_seq-Reaktion in einem Schraubverschlussröhrchen (siehe Tabelle 1).
   Anmerkung: Arbeiten Sie mit radioaktiven Reagenzien nur an einem zugelassenen Ort und mit persönlicher Schutzausrüstung.
2. Inkubieren Sie das Röhrchen 1 h lang bei 37 °C in einem Thermomixer, dann 5 min lang bei 95 °C und legen Sie es 5 min lang auf Eis. Schleudern Sie das gefällte Protein bei 15.700 x g für 5 min herunter und übertragen Sie den Überstand (synthetisiert ³²P-pppGpp) in ein neues Schraubverschlussröhrchen.
3. Um ³²P-ppGpp aus ³²P-ppppp zu synthetisieren, wird die Hälfte des ³²P-pppppp-Produkts in ein neues Schraubverschlussröhrchen überführt und 1 μM GppA hinzugefügt. Inkubieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei 37 °C, 5 Minuten lang bei 95 °C und legen Sie es dann 5 Minuten lang auf Eis.
4. Schleudern Sie das gefällte Protein bei 15.700 x g für 5 min herunter und überführen Sie den Überstand (synthetisiert ³²P-ppGpp) in ein neues Schraubverschlussröhrchen.
5. Analysieren Sie die ³²P-pppGpp und ³²P-ppGpp, indem Sie 1 μl der Proben auf einer Dünnschichtchromatographie (DC)-Platte (Polyethylenimin-modifizierte Cellulose-DC-Platten) unter Verwendung des 1,5 M KH₂PO₄, pH 3,4, als mobile Phase laufen lassen
   Anmerkung: Verwenden Sie das ^α-32P-markierte Guanosin-5'-triphosphat (³²P-α-GTP) als Kontrolle.
6. Trocknen Sie die DC-Platte vollständig, legen Sie sie zwischen eine transparente Plastikmappe und setzen Sie sie 5 Minuten lang einem Phosphorsieb aus. Visualisieren und quantifizieren Sie die Signale mit einem Phosphorimager.
   Anmerkung: Wenn die Verhältnisse von ³²P-pppGpp und ³²P-ppGpp höher als 85 % sind, kann eine großskalige Reaktion (500 μL, ausreichend für das Screening von 20 96-Well-Platten) unter Verwendung von Tabelle 1 zusammengestellt und synthetisiert werden.

4. DRaCALA-Screening der Zielproteine von (p)ppGpp

1. Tauen Sie 20 μl Ganzzelllysate auf und übertragen Sie sie auf eine 96-Well-Mikrotiterplatte mit V-Boden. 2,5 U/Vertiefung der Endonuklease aus Serratia marcescens zugeben und 15 Minuten lang bei 37 °C inkubieren, um die Lysatviskosität zu verringern. Legen Sie die Lysate für 20 Minuten auf Eis.
2. Mischen Sie ³²P-pppGpp und ³²P-ppGpp im Verhältnis 1:1 und fügen Sie 1x Lysepuffer L1 hinzu, um die Endkonzentration von (p)ppGpp auf 4 nM.
   Anmerkung: Angesichts der chemischen Ähnlichkeit zwischen pppGpp und ppGpp wird eine Mischung aus beiden Chemikalien den Screening-Prozess vereinfachen.
3. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette und gefilterte Pipettenspitzen, um 10 μl des (p)ppGpp-Gemischs hinzuzufügen und mit dem Zelllysat zu mischen. 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
4. Waschen Sie den 96 x Stecknadeln, indem Sie ihn 30 s lang in eine 0,01%ige Lösung aus nichtionischem Reinigungsmittel legen und 30 s lang auf Seidenpapier trocknen. Wiederholen Sie das Waschen des Stecknadelwerkzeugs 3x.
5. Platzieren Sie das Stiftwerkzeug in den obigen 96-Well-Probenplatten und warten Sie 30 s. Heben Sie das Stiftwerkzeug gerade nach oben an und platzieren Sie es gerade nach unten auf einer Nitrozellulosemembran für 30 s.
   Anmerkung: Wenn ein Fleck fehlt, spotten Sie 2 μl der entsprechenden Proben mit einer Pipette und filtrierten Spitzen. Es ist ratsam, einen doppelten Fleck derselben Probe zu machen, wie unten angegeben.
6. Trocknen Sie die Membran 5 Minuten lang bei RT. Legen Sie die Membran zwischen eine transparente Plastikmappe und setzen Sie sie 5 Minuten lang einem Phosphorsieb aus. Visualisieren Sie mit einem Phosphorimager.

5. Quantifizierung und Identifizierung potenzieller Zielproteine

1. Verwenden Sie die Analysesoftware, die mit dem Phosphorimager verbunden ist, um die .gel-Datei der visualisierten Platten zu öffnen. Verwenden Sie die Array-Analysefunktion, um die 96 Punkte zu definieren, indem Sie ein Raster mit 12 Spalten x 8 Zeilen einrichten.
2. Definieren Sie große Kreise, um den äußeren Rand der gesamten Punkte zu umschreiben (siehe Abbildung 1). Exportieren Sie das Volumen+Hintergrund und die Fläche der definierten großen Kreise und speichern Sie sie in einer Tabelle.
   Anmerkung: Positionieren Sie bei Bedarf jeden einzelnen Kreis so, dass er perfekt mit den Punkten überlappt, und ändern Sie die Größe jedes einzelnen Kreises, um ihn etwas größer als den tatsächlichen Punkt zu machen.
3. Verkleinern Sie die definierten Kreise, um die kleinen inneren Punkte zu umschreiben. Exportieren Sie den Lautstärke+Hintergrund und den Bereich der definierten kleinen Kreise und speichern Sie sie in einer Tabelle.
4. Berechnen Sie die Bindungsbrüche in der Tabelle anhand der Gleichung in Abbildung 1, und stellen Sie die Daten grafisch dar. Identifizieren Sie die potentiell bindenden Proteine in den Wells, die im Vergleich zu den meisten anderen Wells hohe Bindungsfraktionen aufweisen.

Tabelle 1: Zusammenstellung von Informationen für die klein- und großskaligen Synthesereaktionen von ³²P-markiertem pppGpp. *10x Relseq-Puffer enthält 250 mM Tris-HCl, pH 8,6; 1M NaCl; 80 mM MgCl₂. Abkürzung: pppGpp = Guanosinpentaphosphat.

kg

	Volumen (μL)
	Kleiner Maßstab	Großflächig
Reinstwasser
10x Relseq-Puffer*	arabische Ziffer	Nr. 50
ATP (8 mM Finale)
Relseq (4 μM Finale)
32P-α-Guanosintriphosphat (GTP) (final 120 nM) (VORSICHT)	0,2	5
gesamt	20	500

Ergebnisse

Abbildung 1: Quantifizierung und Berechnung des Bindungsanteils. Weitere Informationen finden Sie im Text. Kurz gesagt, werden die DRaCALA-Spots analysiert, indem zwei Kreise gezeichnet werden, die den gesamten Fleck und den inneren dunklen Punkt (d.h. das zurückgehaltene (p)ppGpp aufgrund der Bindung des getesteten Proteins) umschreiben. Das spezifische Bindungssignal ist das radioakti...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
32P-α-GTP	Perkinelmer	BLU006X250UC
96 x Stiftwerkzeug	V&P Scientific	VP 404	96 Bolzen Replikator, auf 9 mm Mitte, 4,2 mm Bolzendurchmesser, 24 mm lang
96-Well-Mikrotiterplatte mit V-Boden	Sterilin	MIC9004	Sterilin Mikrotiterplatte V Well 611V96
Agar	OXOID - Thermo Fisher	Nr. LP0011	Agar Nr. 1
ASKA Sammelstamm	NBRP, SHIGEN, JAPAN		Ref: DNA Research, Band 12, Ausgabe 5, 2005, Seiten 291–299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012
Benzonase	Sigma	E1014-25KU	gentechnisch veränderte Endonuklease aus Serratia marcescens
Bradford-Protein-Assay-Farbstoff	Bio-Rad	5000006	Reagenz-Konzentrat
Dmso	Sigma	Nr. D8418	≥99,9 %
DNase 1	Sigma	DN25-1G
Filtration für Gel10x300 Säule	GE Gesundheitswesen	28990944	enthält 20% Ethanol als Konservierungsmittel
Glycerin	PanReac AppliChem	Artikel-Nr.: 122329.1214	Glycerin 87% für die Analyse
Hyperkassette	Amersham	RPN 11647	20 x 40 cm
Imidazol	Sigma	Artikel-Nr.: 56750	puriss. p.a., ≥ 99,5% (GC)
IP-Speicher-Phosphor-Bildschirm	FUJIFILM	28956474	BAS-MS 2040 20x 40 cm
Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG)	Sigma	Nr. I6758	Isopropyl β-D-Thiogalactosid
Lysogeny-Bouillon (LB)	Invitrogen - Thermo Fisher	12795027	Miller's LB Bouillon Basis
Lysozym	Sigma	Nr. L4949	aus Hühnereiweiß; BioUltra, lyophilisiertes Pulver, ≥98%
MgCl2 (Magnesiumchlorid)	Sigma	208337
MilliQ Wasser			Reinstwasser
Mehrkanal-Pipette	Thermo Scientific	4661110	F1 - Clip-Spitze; 1-10 ul, 8 x Kanäle
NaCl	VWR Chemikalien	Artikel-Nr.: 27810	AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.
Ni-NTA Agarose	Qiagen	Artikel-Nr.: 30230
Nitrozellulose-Blotting-Membran	Amersham Protran	10600003	Premium 0.45 um 300 mm x 4 m
Pbs	OXOID - Thermo Fisher	BR0014G	Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (Dulbecco A), Tabletten
PEG3350 (Polyethylenglykol 3350)	Sigma	202444
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)	Sigma	Artikel-Nr.: 93482	Phenylmethansulfonylfluoridlösung - 0,1 M in Ethanol (T)
Phosphor-Imager	GE Gesundheitswesen	28955809	Typhoon FLA-7000 Phosphor-Imager
Pipettenspitzen, gefiltert	Thermo Scientific	94410040	ClipTip 12,5 μl unsteril
Poly-Prep Chromatographie-Säule	Bio-Rad	7311550	Chromatographiesäule aus Polypropylen
Proteasehemmer Mini	durchbohren	Nr. A32955	Tabletten, EDTA-frei
Röhrchen mit Schraubverschluss	Thermo Scientific	3488	Mikrozentifugenröhrchen, 2,0 ml mit Schraubverschluss, unsteril
SLS 96-tiefe Well-Platten	Greiner	780285	MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Boden, Natur
Spin-Spalte	Millipore	UFC500396	Amicon Ultra -0,5 ml Zentrifugalfilter
Thermomixer	Eppendorf	5382000015	Thermomischer C
DC-Platte (PEI-Zellulose, F, DC-Platten)	Merck Millipore	105579	DC PEI-Zellulose F (20 x 20 cm)
Tris	Sigma	Nr. BP152	Tris-Basis für die Molekularbiologie
Tween 20	Sigma	Nr. P1379	viskoses nichtionisches Reinigungsmittel
β-Mercaptoethanol	Sigma	Nr. M3148	99% (GC/Titration)

kg