Fluoreszenzsonden-Imaging-Assay: Eine Technik zur Visualisierung von oxidativem Stress in kultivierten Darmorganoidzellen von reaktiven Sauerstoffspezies, die mit Induktoren behandelt wurden

Zusammenfassung

Quelle: Stedman, A. et al., Analyse von oxidativem Stress in murinen Darmorganoiden mit einer reaktiven Sauerstoffspezies-empfindlichen fluorogenen Sonde. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video beschreibt die Technik zur Visualisierung von oxidativem Stress in kultivierten Organoiden. Diese Arbeit hilft dabei, das Ausmaß des oxidativen Stresses aufgrund der ROS-Akkumulation in den verschiedenen Zelltypen zu verstehen, die in einem Organoid nach der Behandlung mit verschiedenen ROS-Modulatoren vorhanden sind.

Protokoll

1. Visualisierung von oxidativem Stress in 3D-Organoiden durch konfokale Mikroskopie

1. Nehmen Sie die Organoide, die in den μ-Slide 8-Well-Kammern plattiert sind, und fügen Sie 1 μl N-Acetylcystein oder NAC-Stammlösung in die entsprechenden Wells hinzu, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
2. 1 h bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren.
3. Geben Sie 1 μl tBHP-Stammlösung in die entsprechenden Vertiefungen, um eine Endkonzentration von 200 μM zu erhalten.
4. 30 min bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren.
5. Fügen Sie 1 μl pro Vertiefung der 1,25 mM-Verdünnung der fluorogenen Sonde hinzu, um eine Endkonzentration von 5 μM zu erhalten.
6. Fügen Sie 1 μl pro Vertiefung der 1,25 mg/ml-Verdünnung von Hoechst hinzu, um eine Endkonzentration von 5 μg/ml zu erhalten.
7. 30 min bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren.
8. Entfernen Sie das Medium, ohne das BMM zu stören. Vorsichtig 250 μl warmes DMEM ohne Phenolrot zugeben.
   Anmerkung: Wenn eine langfristige Anschaffung geplant ist, fügen Sie DMEM ohne Phenolrot Wachstumsfaktorverbindungen hinzu.
9. Die Organoide werden mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet, das mit einer thermischen Kammer und einer Gasversorgung ausgestattet ist und die fluorogene Sonde (ROS) detektiert.
   Anmerkung: Die Anregung/Emission (ex/em) für die fluorogene Sonde beträgt 644/665, ex/em für Hoechst (Zellkerne) 361/486 und ex/em für GFP (intestinale Stammzelle aus den Lgr5-GFP-Mäusen) 488/510. Ein 63-fach-Öl-Immersionsobjektiv wird verwendet, um Signale in Stammzellen zu detektieren. Ändern Sie die Lasereinstellungen nicht zwischen den Proben. Ein 20x-Objektiv kann verwendet werden, um einen Überblick über die ROS-Produktion zu ermöglichen.
10. Verwenden Sie die Positivsteuerung, um die Laserintensität und die Belichtungszeit für das ROS-Signal einzustellen, und überprüfen Sie, ob dieses Signal in der Negativkontrolle niedriger ist.
11. Prüfen Sie den Objektträger mit dem Okular, um die exprimierenden GFP-Organoide zu identifizieren und die Laserintensität einzustellen.
    Anmerkung: Dieser Schritt wird manuell ausgeführt.
12. Definieren Sie Positionen, um ein zusammengefügtes Bild des gesamten Organoids zu erhalten. Richten Sie einen Z-Stack von 25 μm (Schrittweite 5 μm) ein, um einen Ausschnitt der Organoide zu erhalten, der eine Zellschicht zeigt.
    Anmerkung: Lesen Sie das Benutzerhandbuch des Mikroskops, um die Einrichtung zu optimieren. Mit lebenden Zellen sollte die Entnahme innerhalb von 1 h nach Ende der Inkubation erfolgen.
13. Öffnen Sie die Bilder in einer Open-Source-Bildbearbeitungssoftware (siehe Materialtabelle).
14. Gehen Sie durch den Z-Stapel und wählen Sie den Abschnitt, in dem die Mitte der Organoide gut dargestellt ist, und erstellen Sie ein neues Bild mit dem ausgewählten Bereich.
15. Quantifizieren Sie die Bilder gemäß den folgenden Schritten.
    1. Wählen Sie das Freihand-Linienwerkzeug aus.
    2. Zeichne eine Linie entlang der Kerne.
       Anmerkung: Wählen Sie nur Regionen aus, die GFP-positive Zellen aufweisen, wenn nur Stammzellen analysiert werden.
    3. Erhöhen Sie die Linienbreite, um die Zellenschicht mit der Linie zu bedecken, ohne die luminalen Ablagerungen einzubeziehen.
    4. Wählen Sie den Kanal für das ROS-Signal aus, messen Sie die Fluoreszenzintensität im ausgewählten Bereich und kommentieren Sie die Werte.
    5. Zeichnen Sie eine Linie, wo kein Signal vorhanden ist, und messen Sie die Fluoreszenzintensität des Hintergrunds, die vom vorherigen Wert subtrahiert wird, um die endgültige Intensität zu erhalten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Mäuse
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5- GFP)	Das Jackson-Labor
Medium der Wachstumskultur
Erweitertes DMEM F12 (DMEM/F12)	ThermoFisher	12634010
Penicillin-Streptomycin (P/S)	ThermoFisher	15140122	Stammkonzentration: 100x (10.000 Einheiten/ml Penicillin und 10.000 μg/ml Streptomycin)
FLuoroBrite DMEM (DMEM ohne Phenolrot)	ThermoFisher	A1896701
Hoechst 33342	ThermoFisher	Nr. H3570	Bestand bei 10 mg/mL
Matrigel Wachstumsfaktor reduziert, phenolrotfrei (Basalmembranmatrix)	Corning	356231	Nach dem Auftauen O/N im Kühlschrank 1 Stunde auf Eis aufbewahren und 500 mL Aliquots herstellen und bei -20 °C lagern
μ-Slide 8 Well Kammern	Ebd.	Nr. 80826
N-Acetylcystein (NAC)	Sigma	Nr. A9165
tert-Butylhydroperoxid (tBCHP)-Lösung (70 Gew.-% In H2O2)	Sigma	458139
Programme und Ausstattung
Fidschi/ImageJ			https://imagej.net/software/fiji/ Downloads, Bildgenerierung
Beobachter.Z1	Zeiss		konfokales System
Opterra (konfokales Swept-Field)	Bruker		konfokales System
Hochgeschwindigkeits-EMCCD-Kamera Evolve Delta 512	Photometrie		konfokales System
Prisma	GraphPad-Software		statistische Analyse