Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Herstellung von Reagenzien und Materialien für die Kultivierung von Darmorganoiden
- Zur Herstellung des Wachstumskulturmediums mischen Sie fortgeschrittenes DMEM/F-12, ergänzt mit 1x Glutamin, 1x Penicillin/Streptomycin (P/S)-Lösung, 10 mM HEPES, 50 ng/ml Maus-EGF, 20 μg/ml murinem Noggin, 500 ng/ml Maus-R-Spondin1 (siehe Materialtabelle). Lassen Sie das Medium während der Extraktion der Krypta bei Raumtemperatur (RT).
Anmerkung: Frieren Sie das unbenutzte Medium in Aliquoten bei -20 °C ein. Vermeiden Sie ein Einfrieren und Auftauen.
- Füllen Sie ein 50-ml-Röhrchen mit 40 mL Advanced DMEM/F-12 und halten Sie es auf Eis.
Anmerkung: Halten Sie das unbenutzte Medium bei 4 °C. Es wird für die Organoid-Passage verwendet.
- Die Zellkulturplatten (96-Well-Rundboden) im Inkubator bei 37 °C vorwärmen.
Tauen Sie - die Basalmembranmatrix (BMM) (siehe Materialtabelle) auf Eis auf (vor dem Start des Protokolls oder mindestens 1 h vor dem Plattieren von Krypten).
Anmerkung: Das BMM verfestigt sich schnell, wenn es nicht kalt gehalten wird.
- Bereiten Sie die Wasch-/Spüllösung vor, indem Sie 1%ige Penicillin-Streptomycin-Lösung zu DPBS (DPBS-P/S) hinzufügen.
- Füllen Sie eine 100 mm Petrischale mit 10 mL kaltem DPBS-P/S. Füllen Sie sechs 15 mL Röhrchen mit 10 mL DPBS und beschriften Sie diese von F1 bis F6.
- Bereiten Sie 30 ml 10 mM EDTA-Lösung durch Verdünnung von 0,5 M EDTA in DPBS vor. Füllen Sie zwei 15-ml-Röhrchen mit 10 mL 10 mM EDTA und beschriften Sie sie mit E1 und E2.
- Bewahren Sie alle Lösungen bei 4 °C vorgekühlt auf und bewahren Sie sie während des Eingriffs auf dem Eis auf.
2. Kultur von Darmorganoiden
- Opfern Sie eine 8-10 Wochen alte Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) Maus gemäß den nationalen Vorschriften und Vorschriften.
- Sammeln Sie 5-8 cm des Jejunums, das die Region zwischen dem Zwölffingerdarm (5 cm vom Magen) und dem Ileum (10 cm vom Blinddarm entfernt) umfasst, und bewahren Sie es in kaltem DPBS-P/S auf Eis auf.
- Reinigen Sie den Darminhalt, indem Sie ihn mit 5-10 ml kaltem DPBS-P/S.
Anmerkung: Selbstgemachte Spülspritzen erhalten Sie, indem Sie eine 200-μl-Spitze auf eine 10-ml-Spritzendüse stecken.
- Öffnen Sie den Darm mit einer Kugelschere (siehe Materialtabelle) in Längsrichtung (um eine Beschädigung des Gewebes zu vermeiden).
- Übertragen Sie das Gewebe mit einer Pinzette in eine Petrischale mit kaltem DPBS-P/S bei Raumtemperatur und schütteln Sie es zum Spülen.
- Fassen Sie den Darm mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff durch Aspiration und übertragen Sie ihn in ein 15-ml-Röhrchen mit der Bezeichnung E1, das 10 mL kaltes 10 mM EDTA enthält.
- Drehen Sie das Röhrchen 3 Mal um und inkubieren Sie es 10 Minuten lang auf Eis.
- Übertragen Sie das Gewebe mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff in ein Röhrchen F1 mit 10 ml DPBS. 2 min Vortex (bei normalem Vortex, den Schlauch mit der Hand halten und darauf achten, dass der Darm schön wirbelt).
- Geben Sie 10 μl der Fraktion in eine Petrischale und beurteilen Sie die Qualität der Fraktion unter dem Mikroskop.
Anmerkung: Alle Wirbelschritte werden mit maximaler Geschwindigkeit ausgeführt, und die Qualität jeder Fraktion sollte unter dem Mikroskop beurteilt werden (Abbildung 1).
Fassen Sie - mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff den Darm durch Aspiration und übertragen Sie ihn in ein Röhrchen F2 mit 10 mL DPBS und wirbeln Sie es 2 Minuten lang.
- Wiederholen Sie Schritt 2.10, indem Sie das Gewebe in ein Röhrchen F3 mit 10 mL DPBS übertragen und 2 Minuten lang vortexen.
Die - EDTA-Inkubation wie in Schritt 2.6 wiederholen und das Gewebe in ein Röhrchen E2 mit 10 mM EDTA übertragen.
- Das Röhrchen 3 Mal umdrehen und 5 min auf Eis inkubieren.
- Wiederholen Sie Schritt 2.10, indem Sie das Gewebe in ein Röhrchen F4 mit 10 mL DPBS übertragen und 3 Minuten lang vortexen.
- Schritt 2.14 wiederholen, das Gewebe in ein Röhrchen F5 mit 10 ml DPBS übertragen und 3 Minuten lang vortexen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.15, indem Sie das Gewebe in ein Röhrchen F6 mit 10 mL DPBS übertragen und 3 Minuten lang vortexen.
- Kombinieren Sie die besten Fraktionen, die durch die Schwerkraft durch ein 70-μm-Zellsieb gefiltert werden, in ein 50-ml-Röhrchen (auf Eis), um Zotten und signifikante Ablagerungen zu entfernen.
Anmerkung: Normalerweise sind F5 und F6 die Fraktionen, die zahlreiche Krypten und weniger Schmutz enthalten.
- Die Krypten bei 150 x g bei 4 °C 3 min schleudern.
- Leeren Sie das Röhrchen, brechen Sie das Pellet mechanisch auf und fügen Sie 5 mL kaltes DMEM/F12 hinzu.
- Geben Sie 10 μl der Suspension in eine Petrischale und zählen Sie die Anzahl der im Aliquot vorhandenen Krypten manuell unter einem Mikroskop.
Anmerkung: Zählen Sie keine einzelnen Zellen oder kleine Ablagerungen.
- Berechnen Sie das Volumen (V) der erforderlichen Kryptensuspension in μL, wobei berücksichtigt wird, dass 300 Krypten pro Vertiefung plattiert werden, W die Anzahl der Vertiefungen und N die Anzahl der Krypten ist, die von 10 μl der Suspension gezählt werden. Übertragen Sie die Krypten auf ein neues 15-ml-Röhrchen.
Anmerkung: V = 300 x B x 10/N. Wenn im geplanten Experiment ein kleines Volumen verwendet wird, kann ein 1,5 mL Zentrifugenröhrchen verwendet werden.
- Die Krypten bei 200 x g bei 4 °C 3 min drehen.
- Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette.
- Brechen Sie das Pellet mechanisch auf und fügen Sie vorsichtig Wachstumskulturmedium hinzu, um eine Konzentration von 90 Krypten/μl zu erhalten.
- Fügen Sie 2 Volumen unverdünntes BMM hinzu, um eine Endkonzentration von 30 Krypten/μl zu erreichen. Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, ohne Luftblasen in die Mischung zu bringen.
Anmerkung: Halten Sie das Rohr immer auf Eis, um eine Verfestigung des BMM zu vermeiden.
- Platte 10 μL der Krypten/BMM in jede Vertiefung mischen. Verwenden Sie für die Durchflusszytometrie-Analyse 96-Well-Platten mit rundem Boden. Verteilen Sie 10 μl in der Mitte jeder Vertiefung als Kuppel.
Anmerkung: Plattieren Sie die Organoide als dünne Schicht für den bildgebenden Assay, um eine detaillierte Bildgebung zu ermöglichen.
- Lassen Sie die Platte 5 Minuten bei RT, damit das BMM fest werden kann. Stellen Sie die Platte für 15 min bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator.
- Geben Sie 250 μl Wachstumsmedium in jede Vertiefung und achten Sie darauf, dass sich das BMM nicht ablöst.
- Stellen Sie die Platten bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator.
- Führen Sie die ROS-Analyse zwischen Tag 4 und 6 der Kultur durch. Andernfalls wechseln Sie das Medium und spalten die Organoide auf, nachdem mehrere lange knospende Strukturen aufgetreten sind und wenn sich abgestorbene Zellen in den Lumen der Organoide angesammelt haben.
3. Passieren von Organoiden
- Beginnen Sie mit der Passage von Dünndarm-Organoiden ab dem 6. Tag der Kultur, wenn sich signifikante Knospenstrukturen gebildet haben und die Lumen der Organoide dunkel geworden sind.
Anmerkung: Das Lumen des Organoids wird aufgrund der Ansammlung von abgestorbenen Zellen, Ablagerungen und Schleim dunkel. Vermeiden Sie es, die Organoide vor dem Spalten überwachsen zu lassen. Das Spaltverhältnis hängt vom Wachstum der Organoide ab. Es wird empfohlen, die Organoide mit einem Verhältnis von 1:2 am 6. Tag und 1:3 am 10. Tag zu passieren.
- Füllen Sie ein 15-ml-Röhrchen mit 4 mL kaltem Advanced DMEM/F-12 und halten Sie es auf Eis.
Anmerkung: Hier werden Volumina für eine 96-Well-Kulturplatte bereitgestellt. Wenn ein anderes Format verwendet wird, passen Sie die Lautstärke entsprechend an.
- Saugen Sie das Medium vorsichtig mit einer Pipette oder einer Vakuumpumpe aus den Vertiefungen ab, ohne die BMM-Kuppeln zu berühren, und entsorgen Sie es.
- Fügen Sie 100 μl kaltes Advanced DMEM/F-12 pro Vertiefung hinzu. Pipettieren Sie auf und ab, um das BMM aufzubrechen, und übertragen Sie den Inhalt der Vertiefung in das 15-ml-Röhrchen.
- Waschen Sie die Vertiefung mit 200 μl kaltem Advanced DMEM/F-12 und sammeln Sie es in derselben Tube.
Anmerkung: Wenn mehrere Vertiefungen aus derselben Versuchsbedingung durchlaufen werden, kann der Inhalt der Vertiefungen in demselben 15-ml-Sammelröhrchen zusammengefasst werden.
- Drehen Sie das 15-ml-Sammelröhrchen bei 100 x g für 5 min bei 4 °C.
- Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie dem Pellet 1 ml kaltes Advanced DMEM/F-12 hinzu. Nehmen Sie mit einer P1000-Spitze eine P10-Spitze (ohne Filter) auf und pipettieren Sie mindestens 20 Mal auf und ab.
- Geben Sie 4 mL kaltes Advanced DMEM/F-12 in das Röhrchen. Bei 300 x g 5 min bei 4°C schleudern.
- Saugen Sie den Überstand mit einer Pipette oder einer Vakuumpumpe an, ohne das Pellet zu stören. Brechen Sie dann das Pellet mechanisch auf.
- Geben Sie BMM verdünnt in Wachstumskulturmedium (Verhältnis 2:1). Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, ohne Luftblasen in die Mischung zu bringen.
- Platte 10 μL der Krypten/BMM in jede Vertiefung mischen.
- Halten Sie die Platte 5 Minuten lang bei RT, damit sich das BMM verfestigen kann. Stellen Sie die Platte für 15 min bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator.
- Geben Sie 250 μl Wachstumsmedium in jede Vertiefung.
Anmerkung: Achten Sie darauf, das BMM nicht abzunehmen.
- Stellen Sie die Platten bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator.
4. Herstellung von Reagenzien und Materialien zur Beurteilung von oxidativem Stress in Darmorganoiden
- Bereiten Sie eine 250 mM Stammlösung des Inhibitors N-Acetylcystein (NAC) vor (siehe Materialtabelle) und resuspendieren Sie 10 mg mit 245 μl DPBS. Bei einer Endkonzentration von 1 mM verwenden.
- Bereiten Sie eine 50 mM Stammlösung aus Induktor Tert-Butylhydroperoxid (tBHP), 70 % in Wasser, vor und verdünnen Sie 3,22 μl mit 496,8 μl DPBS. Bei einer Endkonzentration von 200 μM verwenden.
- Für die Durchflusszytometrie-Studie wird eine 250 μM Arbeitslösung einer fluorogenen Sonde (siehe Materialtabelle) hergestellt, indem die Stammlösung 1/10 in DMSO verdünnt wird. Bei einer Endkonzentration von 1 μM verwenden.
Anmerkung: Wie in den Herstellerangaben angegeben, ist die fluorogene Sonde licht- und sauerstoffempfindlich. Aktien und Aliquots sollten nicht zu oft geöffnet und geschlossen werden.
- Bereiten Sie eine endgültige Lösung von 0,1 μg/ml DAPI in DPBS vor, die für die Unterscheidung toter Zellen im Durchflusszytometrie-Assay verwendet wird.
Anmerkung: In diesen Schritten wird die Verwendung von Negativ- und Positivkontrollen beschrieben, die unter den in Abbildung 2A dargestellten Bedingungen in alle Assays einbezogen werden müssen. Der Assay kann zum Testen von anti- oder prooxidativen Verbindungen verwendet werden. Die Schritte sind die gleichen, und der einzige Unterschied besteht darin, wenn die Verbindungen vor der Verwendung des fluorogenen Farbstoffs hinzugefügt werden.
5. Quantifizierung des oxidativen Stresses auf die dissoziierten Organoide mittels Durchflusszytometer
- 1 μl NAC-Stammlösung für Negativkontrollen in die Vertiefungen geben, um eine Endkonzentration von 1 mM.
zu erhalten
Anmerkung: Verwenden Sie die Organoide, die in den 96-Well-Platten mit rundem Boden plattiert sind.
- 1 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
- Geben Sie 1 μl tBHP-Stammlösung in die entsprechenden Vertiefungen, um eine Endkonzentration von 200 μM zu erhalten.
- 30 min bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
- Entfernen Sie mit einer Mehrkanalpipette das Medium, ohne das beigefügte BMM zu stören, und übertragen Sie es auf eine andere runde 96-Well-Bodenplatte. Bewahren Sie diese Platte beiseite auf.
- Fügen Sie 100 μl Trypsin hinzu und pipettieren Sie mit einer Mehrkanalpipette mindestens fünfmal auf und ab, um das BMM zu zerstören.
Nicht - länger als 5 min bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
- Pipettieren Sie mit einer Mehrkanalpipette mindestens fünfmal auf und ab, um die Organoide zu dissoziieren.
- Bei 300 x g für 5 min bei RT drehen.
- Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte umdrehen. Geben Sie das in Schritt 6.3 gesammelte Medium wieder in die entsprechenden Vertiefungen und resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie 5 Mal auf und ab pipettieren.
- Fügen Sie die fluorogene Sonde mit einer Endkonzentration von 1 μM hinzu. Fügen Sie 1 μl pro Vertiefung aus der 250 μM-Verdünnung hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 ΰC und 5 % CO2,
Anmerkung: Geben Sie die fluorogene Sonde nicht in die Vertiefungen, die für die Einstellungen des Geräts erforderlich sind (Abbildung 2B).
- Bei 300 x g für 5 min bei RT drehen.
- Resuspendieren Sie die Zellen mit 250 μl 0,1 μg/ml DAPI-Lösung. Übertragen Sie die Proben in die entsprechenden Durchflusszytometrie-Röhrchen, halten Sie die Röhrchen auf Eis und fahren Sie mit der Analyse fort.
Anmerkung: Fügen Sie PBS anstelle von DAPI zu den Vertiefungen hinzu, die für die Einstellungen des Geräts erforderlich sind (Abbildung 2B).
- Optimieren Sie die Einstellungen für die Vorwärts- und Seitenstreuspannung für ungefärbte Steuer- und Laserspannungen für jedes Fluorophor mit monogefärbten Proben.
- Erfassen Sie mit einer geeigneten Gating-Strategie (Abbildung 3A) mindestens 20.000 Ereignisse.
HINWEIS: Es werden 50.000 Ereignisse bevorzugt. Die detaillierten Erfassungseinstellungen variieren je nach verwendetem Gerät.
