SUMOylation Assay: Eine in vitro Technik zum Nachweis des SUMOylierungsstatus von Substratproteinen durch Immunoblotting

Zusammenfassung

Quelle: Yang, W. S. et al., In-vitro-SUMOylierungsassay zur Untersuchung der SUMO E3-Ligase-Aktivität. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video demonstriert die in vitro Methode zur SUMOylierung von Substratproteinen unter Verwendung einer sequentiellen Enzymkaskade. Weiterhin wird der SUMOylierte Status des Proteins mit Hilfe der Elektrophorese- und Immunblotting-Technik identifiziert.

Protokoll

1. Vorbereitung von Baculovirus-Expressionskonstrukten

1. Aufreinigung der SUMO E3-Ligase K-bZIP durch Klonierung der cDNA von K-bZIP in einen Baculovirus-Vektor mit doppelter Expression (siehe Materialtabelle) mit einem N-terminalen Epitop-Tag. Wir hatten Erfolg mit einem Octapeptid-Tag (im gesamten Protokoll als vector-tag-K-bZIP angegeben).
   Anmerkung: Das DNA-Template für die Klonierung der K-bZIP-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist cDNA-reverse transkribiert von RNA, die nach einer Doxycyclin-Behandlung aus TREx F3H3-K-RTA BCBL-1-Zellen isoliert wurde.
   1. Übertragen Sie die K-bZIP-cDNA in voller Länge in den dualen Expressionsvektor mit CpoI-Klonierungsstellen. CpoIch verdaue das PCR-Produkt und 1 μg des dualen Expressionsvektors bei 37 °C für 3 h.
   2. Trennen und extrahieren Sie die verdaute DNA nach Elektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel. Ligate des Inserts (K-bZIP) und des Vektors durch T4-DNA-Ligase bei 16 °C für 30 min gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
   3. 5 μl Ligations-DNA zu 50 μl kompetenten E. coli-Zellen "A" (siehe Materialtabelle) in einem 1,5-ml-Röhrchen geben. 30 Minuten auf Eis legen. Inkubieren Sie dann das 1,5 mL Röhrchen in einem 42 °C Wasserbad für 45 s und legen Sie das Röhrchen sofort für 3 min auf Eis.
   4. Geben Sie 600 μL S.O.C.-Medium (0,5 % (w/v) Hefeextrakt, 2 % (w/v) Trypton, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM MgSO₄ und 4 % (w/v) Glukose) in das Röhrchen und inkubieren Sie 1 h lang bei 37 °C. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur für 3 min bei 600 x g.
   5. Überstand entfernen, Pellet mit 60 μl Luria-Bertani-Medium (LB; 1 % (w/v) Trypton, 0,5 % (w/v) Hefeextrakt und 85 mM NaCl) resuspendieren und auf LB-Agarplatten mit 100 μg/ml Ampicillin verteilen. Inkubieren Sie die Agarplatte bei 37 °C für 16 h.
   6. Wählen Sie 1 Kolonie aus, um sie in 5 mL LB Medium mit 100 μg/ml Ampicillin zu impfen und 16 h lang bei 37 °C und 250 U/min zu kultivieren. Extrahieren Sie dann das Plasmid, vector-tag-K-bZIP, mit einem Plasmid-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
2. Erzeugen Sie das rekombinante Bacmid, das das tag-K-bZIP beherbergt, durch die Transformation des Vektor-tag-K-bZIP in kompetente E. coli-Zellen "B" (siehe Materialtabelle).
   1. Mischen Sie 0,2 μg Vektor-Tag-K-bZIP-Plasmid und 100 μl kompetentes E. coli Zellen "B" in ein 1,5 mL Röhrchen geben und für 30 min auf Eis legen. Inkubieren Sie das Röhrchen in einem 42 °C Wasserbad für 45 s und legen Sie das Röhrchen sofort für 3 min auf Eis.
   2. 900 μl S.O.C.-Medium in das Röhrchen geben und 4 h lang bei 37 °C mit Drehung bei 50 U/min inkubieren. Nehmen Sie als nächstes 10 μl des Mediums und fügen Sie weitere 50 μl S.O.C.-Medium hinzu, um es auf LB-Agarplatten zu verteilen, die 50 μg/ml Kanamycin, 7 μg/ml Gentamicin, 10 μg/ml Tetracyclin, 100 μg/ml Galactosidase-Substrat und 40 μg/ml Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) enthalten. und die Platten 48 h bei 37 °C inkubieren.
   3. Eine weiße Kolonie wird in ein 5 ml LB-Medium geimpft, das 50 μg/ml Kanamycin, 7 μg/ml Gentamicin und 10 μg/ml Tetracyclin enthält. Inkubieren bei 37 °C und 250 U/min 16 h lang schütteln.
   4. Isolieren Sie die rekombinante Bacmid-DNA, die das tag-K-bZIP beherbergt, quantifizieren Sie sie und re-suspendieren Sie sie in einer Konzentration von 1 μg/μl.
3. Erzeugung rekombinanter Baculoviren, die tag-K-bZIP exprimieren, durch Transfization von 1 μg rekombinanter Bacmid-DNA, die tag-K-bZIP enthält, in Sf9-Zellen in einer Vertiefung einer 6-Well-Platte.
   1. 2 x 10⁶ Sf9-Zellen (siehe Materialtabelle) in 2 mL Grace's Insect Medium, geliefert mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Gentamicin in jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte, säen und dann 1 h bei 27 °C inkubieren.
   2. Bewahren Sie eine Log-Phasen-Kultur von Sf9-Zellen in Grace's Insect Medium auf, das mit 10 % FBS, 1 % Gentamicin und 1 % Detergent C (siehe Materialtabelle) bei 27 °C in Orbitalsuspension bei 140 U/min geliefert wird. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblau-Färbung; Die Lebensfähigkeit der Zellen sollte 95 % überschreiten. Pflegen Sie die Zellen mit einem Subkultivierungsverhältnis von 1:3 alle 2-3 Tage (minimale Dichte ~0,5 x 10⁶ Zellen/ml).
   3. Geben Sie 2 μl Bacmid-DNA (1 μg/μl) und 98 μl reduziertes Serummedium (siehe Materialtabelle) in ein 2-ml-Röhrchen. Geben Sie dann 4 μl Transfektionsreagenz (siehe Materialtabelle) in das Röhrchen und mischen Sie es gut. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   4. Geben Sie diese Transfektionsmischung (104 μl) in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 12-16 h lang bei 27 °C.
   5. Entfernen Sie das erschöpfte Medium durch sanfte Aspiration und ersetzen Sie es durch 2 ml frisches Grace's Insect Medium, das mit 10 % FBS und 1 % Gentamicin geliefert wird. Die Sf9-Zellen haften locker an der Plattenoberfläche und werden durch sanftes Absaugen nicht gestört.
4. Sammeln Sie rekombinante Baculoviren nach der Transfektion und amplifizieren Sie das Baculovirus, um Hochtiterbestände (P1) für weitere Experimente zu erhalten.
   1. 72 h nach dem Wechsel des Mediums die Sf9-Zellen mit einem sterilen Zellheber abkratzen, den Überstand aus jeder einzelnen Vertiefung in einem 1,5-ml-Röhrchen sammeln und 10 s lang vortexen.
   2. Zentrifugieren Sie bei 4 °C für 3 min bei 150 x g. Überstand als P0-Baculovirus sammeln und in 1,5-ml-Röhrchen aliquotieren (1 ml-Baculovirus in jedem Röhrchen). Bei -80 °C lagern.
   3. 1 x 10⁷ Sf9-Zellen in 10 mL Grace's Insect Medium mit 10 % FBS und 1 % Gentamicin in einer 10 cm Petrischale aussäen und 1 h bei 27 °C inkubieren.
   4. Zur Amplifikation von rekombinanten Baculoviren, die tag-K-bZIP exprimieren, wird 0,5 ml P0-Baculovirus zu den ausgesäten Sf9-Zellen hinzugefügt und 48 h lang bei 27 °C inkubiert.
   5. Überstand als P1-Baculovirus in einem 15-ml-Röhrchen auffangen und bis zu 1 Monat bei 4 °C lagern.

2. Reinigung von K-bZIP

1. Bewahren Sie eine logaritäre Phasenkultur von Sf9-Zellen in Grace's Insect Medium auf, das mit 10 % FBS, 1 % Gentamicin und 1 % Detergenzium C bei 27 °C in Orbitalsuspension bei 140 U/min geliefert wird, wie in Schritt 1.3.2 beschrieben.
2. Am Tag der Transduktion 1 ml Baculovirus-haltiger Überstand (P1) in 250 ml Sf9-Zellen mit einer Dichte von 2 x 10⁶ Zellen/ml geben.
3. Inkubieren Sie die Sf9-Zellen 72 h lang bei 27 °C auf einem Orbitalschüttler mit 140 U/min und sammeln Sie sie dann durch Zentrifugation bei 2.740 x g für 15 min bei 4 °C.
4. Überstand entfernen und Zellpellets in 10 mL Lysepuffer (20 mM HEPES pH 7,9, 0,5 M NaCl, 1 % Detergent A (siehe Materialtabelle), 2 % Glycerin, Proteaseinhibitor-Cocktail) entfernen und mit einem Schwebemischer bei 4 °C für 30 min bei 50 U/min drehen.
5. Zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 15.000 x g für 15 Minuten, um den Überstand aufzufangen.
6. Zur Aufreinigung von tag-K-bZIP werden die Zelllysate (10 ml) mit 50 μl antikörpermarkierten magnetischen Kügelchen in 14 ml-Polypropylenröhrchen inkubiert und mit einem Suspensionsmischer 3 Stunden lang bei 4 ΰC bei 50 U/min gedreht. Nach der Proteineinfangung pelletieren Sie die Kügelchen bei 800 x g Zentrifugation für 30 s bei 4 °C. Entfernen Sie den größten Teil des Überstands, suspendieren Sie die Kügelchen wieder im Restvolumen von etwa 1 ml und geben Sie sie zum Waschen in ein 1,5-ml-Röhrchen.
7. Waschen Sie das eingefangene Protein, indem Sie das Röhrchen mit den Kügelchen auf einen Magnetständer stellen und den Überstand entfernen, sobald die Magnetkügelchen vollständig an der Seite des Röhrchens haften.
8. Waschen Sie die Kügelchen viermal mit Lysepuffer.
   1. Geben Sie 1 mL Lysepuffer in 1,5 mL Röhrchen und drehen Sie die Röhrchen 10 Mal um. Das 1,5-ml-Röhrchen wird auf ein Magnetstativ gestellt und der Überstand wird wie unter Nummer 2.7 beschrieben entfernt.
   2. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt noch 3 Mal.
9. Waschen Sie die Kügelchen einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
   1. Geben Sie 1 mL PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na₂HPO₄, 1,5 mM KH₂PO₄) in 1,5 mL Röhrchen und invertieren Sie die Röhrchen 10 Mal.
   2. Legen Sie das 1,5-ml-Röhrchen auf ein Magnetstativ und entfernen Sie dann den Überstand.
10. Eluieren Sie das tag-K-bZIP-Protein aus den Antikörper-markierten magnetischen Kügelchen durch Zugabe von 100 μl 150 μg/ml Octapeptid, verdünnt in PBS, in ein 1,5-ml-Röhrchen. Drehen Sie das Rohr 10 Minuten lang bei 50 U/min mit einem Schwebemischer bei Raumtemperatur. Setzen Sie dann das Röhrchen wieder auf das Magnetstativ und sammeln Sie den K-bZIP-haltigen Überstand in einem sauberen 1,5-ml-Röhrchen.
11. Analysieren Sie 1-5 μl gereinigtes tag-K-bZIP-Protein mit SDS-PAGE, gefolgt von Coomassie-Blau-Färbung. Laden Sie 2 μg, 1 μg und 0,5 μg Proben Rinderserumalbumin (BSA) auf dasselbe Gel und verwenden Sie es für die Quantifizierung mit einem Bildverarbeitungsprogramm wie ImageJ. Schätzen Sie die K-bZIP-Konzentration im Vergleich zu den BSA-Standards.
12. Das aufgereinigte K-bZIP kann nun in jedem SUMOylierungs-Assay verwendet werden. Das K-bZIP wird in PBS auf eine Endkonzentration von 100 ng/μl verdünnt und in kleinen Aliquoten bei -80 °C gelagert.

3. SUMOylierungs-Assay

1. 3 μl mit 100 ng/μl gereinigtem Tag-K-bZIP in den Mastermix jeder In-vitro-SUMOylierungsreaktion geben. Die Komponenten im Mastermix enthalten 1 μl Proteinpuffer, 1x SUMOylierungspuffer, 0,5 μl p53-Protein (0,5 mg/ml), 25 nM E1-aktivierendes Enzym (Stammkonz.: 1 μM), 50 nM E2-konjugierendes Enzym (Stammkonz.: 10 μM) und je 250 nM der SUMO-Peptide (SUMO-1, SUMO-2 oder SUMO-3; Stammkonz.: 5 μM) auf ein Endvolumen von 17 μL.
2. Mischen Sie den Inhalt vorsichtig und inkubieren Sie die Reaktion 3 h lang bei 30 °C. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 20 μl 2x SDS-PAGE-Ladepuffer (100 mM Tris-HCL pH 6,8, 4 % Natriumdodecylsulfat, 0,2 % (w/v) Bromphenolblau, 20 % (v/v) Glycerin und 200 mM β-Mercaptoethanol) und denaturieren Sie die Proben bei 95 °C für 5 min.
3. Trennen Sie die Proben auf SDS-PAGE, übertragen Sie die getrennten Proteine auf die PVDF-Membran unter Verwendung einer halbtrockenen elektrophoretischen Transfervorrichtung und analysieren Sie sie durch Western Blot unter Verwendung eines Anti-p53-Antikörpers.
   1. Richten Sie das Gelgerät ein und laden Sie 20 μl Probe in die Gelvertiefungen.
   2. Lassen Sie das 10%ige Gel in einem konstanten Strom bei 80 V für ca. 120 min laufen (bis das Färbeband den Boden des Gels erreicht). Schalten Sie nach Abschluss der Elektrophorese die Stromversorgung aus.
   3. Trennen Sie das Gelgerät und die Gelkassetten, um das Gel herauszunehmen, und schwimmen Sie das Gel 5 Minuten lang in einen halbtrockenen Transferpuffer (48 mM Tris-HCl, 39 mM Glycin, 20 % Methanol).
   4. Nehmen Sie einen anderen Behälter und weichen Sie die PVDF-Membran 1 Minute lang in Methanol ein. Nehmen Sie dann PVDF aus dem Methanol und geben Sie es in halbtrockenen Transferpuffer. Rühren Sie die Membran 5 Minuten lang vorsichtig auf.
   5. Entfernen Sie die Sicherheitsabdeckung des halbtrockenen Elektrophoresegeräts.
   6. Befeuchten Sie das Filterpapier vor und bereiten Sie ein Gelsandwich auf der unteren Platinanode wie folgt vor: Filterpapier, PVDF-Membran, Gel und Filterpapier.
   7. Befestigen Sie die Kathodenplatte und die Sicherheitsabdeckung und lassen Sie den Blot 90 Minuten lang mit 15 V Konstantstrom laufen. Schalten Sie die Stromversorgung aus, trennen Sie das halbtrockene Gerät und nehmen Sie die PVDF-Membran heraus.
   8. Block-PVDF-Membran mit Blockpuffer (5 % fettfreie Milch in TBST-Puffer (137 mM NaCl2, 20 mM Tris-HCl, 0,1 % Detergens B (siehe Materialtabelle), pH 7,6)) bei Raumtemperatur für 1 h mit 30 U/min Schütteln durch Orbitalschüttler.
   9. Hybridisieren Sie die PVDF-Membran mit Anti-p53-Antikörpern, die in einem Blockierungspuffer für 12-16 h bei 4 °C und 30 U/min verdünnt wurden und unter Verwendung eines Suspensionsmischers (1:1.000) geschüttelt wurden.
   10. Nehmen Sie die PVDF-Membran aus und geben Sie TBST ein. Spülen Sie die PVDF-Membran noch zweimal mit TBST.
   11. Weichen Sie die PVDF-Membran 30 Minuten lang in TBST ein, wobei Sie mit einem Orbitalschüttler bei 45 U/min geschüttelt werden.
   12. Hybridisieren Sie die PVDF-Membran mit Anti-Kaninchen-Antikörpern, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (HRP), verdünnt (1:4.000) in Blockierungspuffer für 1 h bei Raumtemperatur und 30 U/min Schütteln unter Verwendung eines Suspensionsmischers.
   13. Waschen Sie die PVDF-Membran 3 Mal mit TBST, wie in Schritt 3.4.10 beschrieben.
   14. Die PVDF-Membran 30 min lang bei 45 U/min unter Schütteln mit einem Suspensionsmischer in TBST einweichen. Entfernen Sie TBST und fügen Sie PBS hinzu, um die PVDF-Membran bis zu 12 h bei 4 °C zu konservieren.
   15. Mischen Sie das verbesserte Chemilumineszenzsubstrat (ECL-Substrat) Reagenz 1 und 2 (1:1) (siehe Materialtabelle). Entfernen Sie die PVDF-Membran aus der PBS, tupfen Sie sie kurz mit einem Papiertuch oder einem leichten Wischer ab, um überschüssige Feuchtigkeit aufzunehmen, und geben Sie sofort 400 μl ECL-Reagenz für 3-5 Minuten auf die Oberfläche jeder Membran. Entfernen Sie überschüssiges ECL-Reagenz durch kurzes Abtupfen, aber lassen Sie die Membran nicht vollständig trocknen.
   16. Belichten Sie den Blot mit einem Lumineszenzbildgebungssystem oder einem Autoradiographiefilm.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
pFastBac	Invitrogen	Tel.: 10359-016	Baculovirus-Vektor mit doppelter Expression
pCR2.1-TOPO-Vektor	Invitrogen		Vektor für PCR-Produkte
kompetente Zelle E. coli DH5α	Hefe Biotech	FYE678-80VL	kompetente E. coli-Zellen A
E. coli DH10Bac	Invitrogen	Tel.: 10359-016	kompetente E. coli-Zellen B
FugeneHD	Roche	4709705001	Transfektions-Reagenz
Opti-MEM	Gibco	31985062	reduzierte Serummedien
T4-Ligase	NEUENGLAND BioLabs	M0202S
CpoI (RsrII)	Thermo Scientific	Nr. ER0741
Bluo-Gal	Thermo Scientific	Nr. B1690	Galactosidase-Substrat
IPTG (IPTG)	Sigma-Aldrich	I6758-1G
Graces Insektenmedium	Gibco	11605094
Fötales Rinderserum	Gibco	10082147
gentamicin	Thermo Fischer	15750060
ampicillin	Sigma-Aldrich	Nr. A9393-25G
Kanamycin	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: K0254-20ML
gentamicin	Gibco	Artikel-Nr.: 15710-064
Tetracyclin	Sigma-Aldrich	87128-25G
LB Brühe	Merk	Artikel-Nr.: 1.10285.0500
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	Nr. S9888-5KG
Kcl	Merk	Artikel-Nr.: 1.04936.1000
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	Nr. S5136-500G
KH2PO4	J.T.Bäcker	Artikel-Nr.: 3246-01
Natriumdodecylsulfat	Merk	1.13760.1000
β-Mercaptoethanol	Bio-Rad	Tel.: 161-0710
TRIS (Basis)	J.T.Bäcker	Nr. 4109-06
Fettfreie Milch	Fonterra
Glycerin	J.T.Bäcker	Artikel-Nr.: 2136-01
Triton X-100	Amresco	0694-1L	Waschmittel A
Tween 20	Amresco	0777-500ML	Waschmittel B
Poloxamer 188 Lösung	Sigma-Aldrich	Nr. P5556-100ML	Waschmittel C
Proteasehemmer Cocktail Tablette	Roche	Tel. 04 693 132 001
3x Flaggen-Peptid	Sigma	Nr. F4799
anti-FLAG m2 Magnetische Perlen	Sigma-Aldrich	M8823	Antikörper-markierte magnetische Kügelchen
SUMOlink SUMO-1 Bausatz	Aktives Motiv	Artikel-Nr.: 40120	Standard-SUMOylierungsprotokoll
SUMOlink SUMO-2/3 Bausatz	Aktives Motiv	Artikel-Nr.: 40220	Standard-SUMOylierungsprotokoll
QIAquick Gel-Extraktionskit	QIAGEN	Artikel-Nr.: 28704
QIAGEN Plasmid Mini-Kit	QIAGEN	Artikel-Nr.: 12123	Plasmid-Extraktionskit
Schläuche aus Polypropylen	Falke	352059
Petrischale	Falke	351029
Zell-Lifter	Corning	CNG3008
Tipp zum Laden	Sorenson BioScience	Artikel-Nr.: 28480
PVDF	PerkinElmer	NEF1002
Filterpapier ablöschen	Bio-Rad	1703932
Mini-Slab-Gel-Gerät (Bio-Rad Mini Protean II Cell)	Bio-Rad	1658001 EDU
Trans-Blot SD Halbtrockene elektrophoretische Transferzelle	Bio-Rad	1703940
Pierce ECL Western Blotting	Thermo	Artikel-Nr.: 32106	ECL-Reagenz
Suspensionsmischer	Digisystem Laborgeräte Inc.	SM-3000
Orbitalschüttler	Kansin Instrumente Co.	OS701
ImageQuant LAS 4000	GE Gesundheitswesen	28955810
Biomolekularer Imager	GE Gesundheitswesen	28955810
Sf9	Thermo Scientific	Nr. B82501
Anti-P53-Antikörper	Zelluläre Signalübertragung	#9282
Anti-Kaninchen-Antikörper	GE Gesundheitswesen	NA934-1ML

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