Fluoreszenz-Mikroplatten-basierter Cycloheximid-Chase-Assay: Eine Technik zur Überwachung der Abbaukinetik von fluoreszierenden nuklearen fehlgefalteten Proteinen

Zusammenfassung

Quelle: Guo, L. et. al., Assays für den Abbau von fehlgefalteten Proteinen in Zellen. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video beschreibt einen in vitro fluoreszenzbasierten Mikroplatten-Assay, um die Abbaukinetik eines fluoreszenzmarkierten, fehlgefalteten Luciferase-mutierten Proteins zu untersuchen, das in den Zellkernen von transfizierten Säugetierzellen exprimiert wird. Der Assay umfasst die Behandlung von Zellen, die das fluoreszierende mutierte Protein exprimieren, mit einem Translationsinhibitor und einem Proteasom-Inhibitor, um den Proteasom-vermittelten Abbau des fehlgefalteten Proteins zu bewerten.

Protokoll

1. Vorbereitung des Reagenzes

1. Bereiten Sie ein DMEM-Medium mit niedriger Fluoreszenz für Assays mit einem Mikrotiterplatten-Fluoreszenz-Reader vor. Mischen Sie 25 mM Glukose, 0,4 mM Glycin, 0,4 mM Arginin, 0,2 mM Cystein, 4,0 mM Glutamin, 0,2 mM Histidin, 0,8 mM Isoleucin, 0,8 mM Leucin, 0,8 mM Lysin, 0,2 mM Methionin, 0,4 mM Phenylalanin, 0,4 mM Serin, 0,8 mM Threonin, 0,078 mM Tryptophan, 0,4 mM Tyrosin, 0,8 mM Valin, 1,8 mM CaCl₂, 0,81 mM MgSO₄, 5,33 mM KCl, 44,0 mM NaHCO₃, 110 mM NaCl, 0,9 mM NaH₂PO₄. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit HCl oder NaOH auf pH 7,4 ein. Sterilisieren Sie das Medium durch Filtration.
   Anmerkung: Dieses Medium enthält Bestandteile des Standard-DMEM-Mediums mit hohem Glukosegehalt, mit der Ausnahme, dass Fe(NO₃)₃, Vitamine und Phenolrot weggelassen werden. Phenolrot, Riboflavin und Pyridoxal in regulärem DMEM-Kulturmedium beeinträchtigen die Detektion des Fluoreszenzsignals erheblich. Kulturmedium ohne diese Komponenten ist entscheidend für eine erfolgreiche GFP-Bildgebung von lebenden Zellen. Das Medium ist 12 Monate lang stabil, wenn es gekühlt gelagert wird.

2. Echtzeit-Degradationsassay von NLS-Luciferase-GFP mit einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader

1. Saat ca. 1 x 10⁴ HeLa-Zellen in schwarze 96-Well-Gewebekulturplatten mit transparentem Boden. Nach O/N-Kultivierung wird zum Zeitpunkt der Transfektion ein Konfluenz von 50-70% erreicht.
   HINWEIS: 60 μl Medium, das vollständig suspendierte HeLa-Zellen enthält, werden direkt in jede Vertiefung ausgesät. Geben Sie nach der Aussaat kein zusätzliches Medium oder keine Gesteinsplatte hin und her, da es sonst zu einer ungleichmäßigen Verteilung der Zellen kommen kann.
2. Transfizieren Sie HeLa-Zellen mit 0,05-0,1 μg NLS-Luciferase-GFP/pRK5-Plasmid in jede Vertiefung unter Verwendung eines Transfektionsreagenzes gemäß den Anweisungen des Herstellers. Stellen Sie eine Master-Transfektionsmischung her, die DNA und Transfektionsreagenz enthält, und aliquotieren Sie sie für jede Vertiefung. Drei Vertiefungen mit Zellen werden nicht mit DNA transfiziert, die als Kontrolle für das Hintergrundfluoreszenzsignal für jede Behandlungsbedingung dient.
   Anmerkung: Eine alternative Möglichkeit, die Transfektionsvariation zu reduzieren, besteht darin, Zellen vor der Aussaat zu transfizieren. Ein großer Teil der Zellen, die mit fehlgefalteten Proteinen transfiziert wurden, kann sich mit dieser Methode jedoch nicht anheften oder zeigt eine verminderte Lebensfähigkeit. Es ist wahrscheinlich, dass einige Zellen dem Stress nicht standhalten, der durch die Trypsinverdauung verursacht wird, wenn toxische fehlgefaltete Proteine exprimiert werden. Dadurch wird das gesamte Fluoreszenzsignal deutlich reduziert.
3. 20-24 Stunden nach der Transfektion untersuchen Sie die lebenden Zellen unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop auf GFP-Expression mit einer Anregungswellenlänge von 450-490 nm.
4. Entfernen des Mediums durch Vakuumaspiration. Geben Sie ca. 200 μl 1x PBS in jede Vertiefung und aspirieren Sie es dann, um die Restmenge des DMEM-Mediums zu entfernen.
5. Zugabe von 60 μl niedrigfluoreszierendem DMEM-Medium mit 5 % FBS und 50 μg/ml CHX. Um den proteasomalen Abbau zu untersuchen, nehmen Sie den zusätzlichen Proteasom-Inhibitor MG132 (10 μM) in einen Probensatz auf. Legen Sie die dreifache Anzahl der Vertiefungen für jede Behandlung/jeden Zustand fest.
   Anmerkung: Die Behandlung mit MG132 wird als Kontrollen für den proteasomalen Abbau eingeschlossen, da es entscheidend ist, andere Faktoren auszuschließen, die zu einem Abfall des Fluoreszenzsignals führen können, einschließlich Zelltod und Fluoreszenzlöschung.
6. Messen Sie das Fluoreszenzsignal von GFP sofort auf einem Fluoreszenzplatten-Reader nach Zugabe von CHX.
   Anmerkung: Die Messeinstellungen der Software sind in Tabelle 1 dargestellt.
7. Lesen Sie die Platte stündlich für bis zu 8-10 Stunden ab. Bringen Sie die Platte nach dem Lesen wieder in den Zellkultur-Inkubator zurück.
8. Exportieren Sie die Daten als Tabellenkalkulationsdatei. Verwenden Sie den Mittelwert von Multi-Reads für jede Vertiefung sowie die Fluoreszenzintensität. Normalisierungswerte der einzelnen Datenpunkte beziehen sich auf die Mittelwerte von Zeit 0 in den jeweiligen Gruppen. Stellen Sie die normierte Fluoreszenzintensität im Zeitverlauf dar, wie in Abbildung 1A und 1B sowie in Abbildung 2 rechts dargestellt.
9. Führen Sie eine statistische Analyse der Degradationsraten zwischen zwei Bedingungen mithilfe einer bidirektionalen ANOVA mit wiederholten Messungen durch.
   Anmerkung: In dieser Analyse ist die "Fluoreszenzintensität" die abhängige Variable, während die "Behandlungsbedingungen" und die "Zeit" die beiden Faktoren sind. Anstatt Daten zu einzelnen Zeitpunkten zu vergleichen, analysiert die bidirektionale ANOVA mit wiederholten Messungen die Differenz zwischen den beiden Behandlungsgruppen über den gesamten Zeitraum.

Tabelle 1: Messeinstellungen am Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader.

Uhr

Definitionsdatei für Platten		GRE96fb
Messmodus		Fluoreszenzintensität Unterseite
Wellenlänge	Wellenlänge der Anregung	485 nm
	Anregungsbandbreite	9 Seemeilen
	Emissionswellenlänge	535 nm
	Emissions-Bandbreite	20 nm
Anzahl der Blitze		5
Verstärkung		Bedienungsanleitung 200
Integrationszeit		20 μs
Mehrere Lesevorgänge pro Vertiefung	Art	Kreis (gefüllt)
	Größe	5×5
	Grenze	400 μm

Ergebnisse

Abbildung 1: Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-basierter Assay für den Abbau von NLS-LucDM-GFP. HeLa-Zellen, die auf 96-Well-Platten ausgesät wurden, wurden mit 0,05 μg (A) oder 0,1 μg (B) NLS-LucDM-GFP transfiziert und in Gegenwart oder Abwesenheit von MG132 mit CHX behandelt. (A und B) Die Fluoreszenzintensitäten der Wells wurden zu...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dulbecco's Modifizierter Eagle Medium	Lebenstechnologien	Nr. 11995-092
Fötales Rinderserum	Lebenstechnologien	10082147
Lipofectamin 2000	Lebenstechnologien	11668019
MG132	Sigma-Aldrich	Nr. M8699
Aminosäuren	Sigma-Aldrich		Aminosäuren werden zur Herstellung von Kultivierungsmedium mit geringer Fluoreszenz verwendet
Cycloheximid	Sigma-Aldrich	Nr. C7698
Olympus IX-81 Inverses Fluoreszenzmikroskop	Olymp	IX71/IX81
96 Well schwarze TC-Platte mit durchscheinendem, klarem Boden	Sigma-Greiner	Artikel-Nr.: 89135-048
Fluoreszenz-Bodenplatten-Reader Infinite 200® PRO	TECAN	Unendlich 200® PRO
Prisma 5	GraphPad		Software für statistische Analysen