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Bioreporter-Assay: Eine empfindliche Technik mit einem biolumineszierenden Reportersystem zum Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern

8. Juli 2025

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Quelle: Rezaei, R. et al., Nachweis von SARS-CoV-2-Rezeptor-Bindungsdomänen-Antikörpern mit einem HiBiT-basierten Bioreporter. J. Vis. Exp. (2021)

In diesem Video zeigen wir den auf dem HiBit-RBD-Bioreporter-System basierenden Assay zum Nachweis von SARS-CoV-2-neutralisierenden Antikörpern. Dieses System zielt auf die virale RBD-Domäne ab, indem es ein biolumineszierendes Reportersystem verwendet, das HiBiT enthält, das mit der RBD-Domäne fusioniert ist.

Protokoll

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1. Nachweis von Anti-RBD-Antikörpern mit einem schnellen und sensitiven Assay

  1. HiBiT-RBD-Antikörper-Nachweisassay
    1. Bereiten Sie den HiBiT-RBD-Bioreporter vor.
      Anmerkung: Es wird empfohlen, den Überstand für den folgenden Assay zu verwenden, da er einfacher zu sammeln ist und die reife glykosylierte Version des Proteins enthält. Darüber hinaus enthält das Lysat mehrere andere Proteine, die die Interaktion zwischen HiBiT-RBD und Antikörpern stören könnten.
    2. Kombinieren Sie 50 μl des HiBiT-RBD-haltigen Überstands mit 1 μg des kommerziellen SARS-CoV-2-RBD-Antikörpers in einem 1,5-ml-Mikroröhrchen. Geben Sie 20 μl Immunglobulin-bindendes Protein (Protein G) in die Lösung. Erhöhen Sie das Gesamtvolumen auf 300 μl durch Zugabe von PBS.
      Anmerkung: Das Gesamtvolumen der Mischung kann auf 150 μl verringert werden. Niedrigere Gesamtvolumina werden nicht empfohlen, da dies zu einer unzureichenden Vermischung der Antikörper mit dem Bioreporter führen kann.
    3. Die Röhrchen werden 30 Minuten lang auf einem Röhrchenschüttler oder Rotator inkubiert. Zentrifugieren Sie 30 s lang bei 12.000 x g, entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie ihn mit PBS. Wiederholen Sie den Vorgang dreimal, um die freie HiBiT-RBD zu entfernen. In 50 μl PBS resuspendieren und auf eine 96-Well-Platte übertragen.
    4. 50 μL 1x LgBiT zugeben und 5 min warten. Fügen Sie dann 50 μl 1x NanoLuc Substrat hinzu. Lesen Sie das Lumineszenzsignal sofort mit einem Luminometer aus.

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Offenlegungen

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Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Bio-Plex Handheld-MagnetscheibeBio-Rad171020100Gerät
Dual-Glo Luziferase-Assay-SystemPromegaNr. E2940100 mL Kit
LgBiTPromegaNr. 3030Assay-Kit
Pierce Protein G Magnetische PerlenThermo Fisher ScientificArtikel-Nr.: 88848Probe
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike-neutralisierender Antikörper, Maus-MabSinoBiologischArtikel-Nr.: 40592-MM57Probe
Synergy Mx Mikroplatten-ReaderBioTek96-Well-Plattenleser-Luminometer

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Schlagwörter

HiBiT RBD Systembiolumineszierender NachweisRBD BindungProtein G BeadsLgBiT SubstratFurimazin OxidationLuminometermessungneutralisierende Antik rper

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