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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
Eine schematische Übersicht über das Assay-Protokoll finden Sie in Abbildung 1.
1. Erste Vorbereitung
- Zur Beurteilung bei Schafen: Blut in 8 mL Serumseparator-Gerinnselaktivatorröhrchen sammeln (siehe Materialtabelle), die Blutprobe 20-30 Minuten bei Raumtemperatur (RT) belassen und anschließend 15 Minuten lang bei 2.100 x g herunterschleudern. Der klare Überstand, der sich an der Oberseite der Röhren bildet, ist Serum. Die klare wässrige Phase wird in Mikrozentrifugenröhrchen aliquotiert und bei -80 °C gelagert
Anmerkung: Das Serum bei -80 °C bleibt ~5 Jahre stabil. Das Blut aus der Halsschlagader wurde mit einer 16-G-Nadel (Spitzenabtrennung) und einer Spritze von bewussten Tieren entnommen.
- Inaktiviertes fötales Rinderserum (FBS) erhitzen, indem es 30 Minuten lang in ein Wasserbad bei 56 °C gelegt und intermittierend geschwenkt wird. Um die Präzision zu erhöhen, legen Sie ein Thermometer in eine zweite Flasche mit dem gleichen Volumen Wasser und geben Sie es gleichzeitig mit der FBS-Flasche in das Wärmebad. Beginnen Sie mit der Zeitmessung, wenn das Thermometer 56 °C erreicht.
- Verwenden Sie die richtige aseptische Technik und Zellkulturpraxis für alle nachfolgenden Schritte, die in der Zellkulturhaube durchgeführt werden. Sprühen Sie vor Gebrauch 70 % Ethanol auf alle Gegenstände und die Haube und reinigen Sie sie nach Beendigung mit 1 % Natriumhypochlorit.
- Vervollständigen Sie Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) durch die Kombination von DMEM (89 %) mit hohem Glukosegehalt (4,5 g/L) mit hitzeinaktiviertem FBS (10 %) und Penicillin-Streptomycin (1 %). Kombinieren und filtrieren Sie mit einem sterilen Vakuumfiltrationssystem (0,22 μm Porengröße, Polyethersulfonmembran) (siehe Materialtabelle). Lagern Sie das komplette DMEM in Folie eingewickelt bei 4 °C.
- HT1080-Zellen werden eingesetzt (siehe Materialtabelle) und in einem 75 cm 2-Quadratkolben durchgelassen. Erstellen Sie mehrere eingefrorene Bestände von Zellen. Verwenden Sie keine Zellen nach 20 Passagen, da eine weitere Passage die Assay-Ergebnisse beeinflussen kann.
2. Tag 1 - Plattierung der Zellen
- Passage HT1080-Zellen, wenn sie eine Konfluenz von ~80 % erreichen.
- Vollständiges DMEM (hergestellt in Schritt 1.4), 0,05 % Trypsin-EDTA und 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) im Wasserbad auf 37 °C vorwärmen. Entfernen Sie das Wachstumsmedium mit einem Aspirationssystem aus den passageierten Zellen.
Anmerkung: Bei allen Aspirationen in diesem Protokoll wird ein Vakuumsystem verwendet, bei dem ein Schlauch an eine sterile serologische 5-ml-Pipette angeschlossen ist.
- Waschen Sie die Zellen in 10 mL vorgewärmtem (37 °C) 1x PBS und trypsinisieren Sie die Zellen 3-4 Minuten lang in 4 mL vorgewärmtem 0,05%igem Trypsin-EDTA, um die Zellen aus dem Kolben zu lösen.
- Inaktivieren Sie das Trypsin, indem Sie 6 ml vorgewärmtes vollständiges DMEM hinzufügen und die Zellen in ein 50-ml-Röhrchen pipettieren. Berechnen Sie die Anzahl und Konzentration lebensfähiger Zellen mit einem Hämozytometer und der Trypanblau-Ausschlussmethode.
- Verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von 1 x 105 Zellen/ml in vorgewärmtem vollständigem DMEM. 100 μl Zellen/Well in durchsichtige 96-Well-Platten mit flachem Boden aussäen (1 x 104 Zellen pro Well). Die Platte bei 37 °C, 5 % Kohlendioxid (CO2) über Nacht 16-22 h inkubieren.
3. Tag 2 - Infizieren der Zellen
- Nehmen Sie die Platte(n) aus dem Inkubator und bestätigen Sie mit einem Lichtmikroskop, dass die Zellen gleichmäßig in den Vertiefungen verteilt sind und dass die Konfluenz ~50% beträgt. Wenn sich die Zellen nicht in einem Bereich von 45 % bis 55 % Konfluenz befinden, wiederholen Sie das "Tag 1"-Protokoll und passen Sie die anfängliche Zellkonzentration entsprechend an.
- Erzeugen Sie serielle Verdünnungen der interessierenden Serumproben in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung von vorgewärmtem vollständigem DMEM als Verdünnungsmittel. Tabelle 1 zeigt die Erzeugung einer Verdünnungskaskade für dreifache Proben.
- Um den Assay in dreifacher Ausführung durchzuführen, bereiten Sie eine 7,5 x106 Vektorgenome (vg)/μl Arbeitslösung von AAV6-hPLAP vor (siehe Materialtabelle), indem Sie eine Virusstammlösung in 1x PBS verdünnen.
- 66 μl der 7,5 x 106 vg/μl Virusarbeitslösung in jedes Röhrchen geben, das 264 μl Serum/Medienverdünnung enthält (330 μl Gesamtvolumen/Verdünnung, siehe Tabelle 1).
Anmerkung: Hierbei handelt es sich um einen robusten Assay, der keine perfekten Kulturbedingungen erfordert. Um jedoch eine genaue Quantifizierung vorzunehmen und sicherzustellen, dass jeder Assay-Lauf zuverlässig ist, ist es notwendig, Folgendes einzubeziehen: (1) eine reine Virus- und Medienkontrolle, (2) eine reine Medienkontrolle und (3) eine NAb-Positivkontrollprobe auf allen Platten unter denselben experimentellen Bedingungen. Das beschriebene Volumen (330 μl) entspricht dreifachen Proben + 10 % des Serum-Virus-Gemisches. Die Durchführung von Replikationen wird dringend empfohlen, um die neutralisierende Aktivität genau zu bestimmen.
- Mischen Sie die Virus-/Serumverdünnungen durch Pipettieren und legen Sie die Röhrchen mit den Virus-Serum-Gemischen 30 Minuten lang bei 37 °Cund 5 % CO 2 in einen Inkubator, damit eine mögliche Neutralisation stattfinden kann.
- Pipettieren Sie 100 μl des Virus-Serum-Gemisches in jede Vertiefung auf der 96-Well-Platte, die 1 x 10 4 Zellen/Vertiefung für jede Verdünnung enthält.
Anmerkung: Dadurch wird eine endgültige Viruskonzentration von 15.000 Viren/Zellmultiplizität der Infektion (MOI) in jeder Vertiefung erzeugt. Tabelle 2 zeigt ein Beispiel für ein 96-Well-Probenplattenlayout für die Beurteilung von Proben bis zu einer Verdünnung von 1/512 .
- Wickeln Sie die 96-Well-Platte mit den Zellen, dem Serum und AAV-hPLAP in Folie ein und legen Sie sie über Nacht für 16-24 Stunden bei 37 °C und 5 % CO2 in einen Inkubator, um den Eintritt des AAV in die Zellen zu ermöglichen.
4. Tag 3 - Fixieren und Hinzufügen von Substrat zu den Zellen
- Erwärmen Sie ein Aliquot von 1x PBS auf 37 °C (~25 mL/96-Well-Platte). Separate Aliquots von PBS (~25 mL/96-Well-Platte) und doppelt destilliertem H2O (DDW, ~25 mL/96-Well-Platte) auf 4 °C abkühlen. Ein Pellet BCIP/NBT (siehe Materialtabelle) in 10 mL DDW in einem konischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen durch Vortexen auflösen (10 mL reichen für 2 x 96-Well-Platten).
- Das Medium wird mit einer serologischen Pipette oder ähnlichem, die an ein saugbasiertes Absaugsystem oder ein Abzugsvakuum angeschlossen ist, aus den Vertiefungen der 96-Well-Platte abgesaugt. Setzen Sie die Spitze der serologischen Pipette vorsichtig in die Vertiefung ein und entfernen Sie das Medium, wobei Sie darauf achten müssen, die anhaftenden Zellen nicht zu beschädigen.
- Geben Sie mit einer Pipette 50 μl RT 4 % PFA in jede Vertiefung. Wickeln Sie die Platte in Folie ein und lassen Sie sie 10 Minuten bei RT, um die Zellen zu fixieren.
Vorsicht: Paraformaldehyd (PFA) ist wahrscheinlich krebserregend und giftig bei Haut- oder Augenkontakt oder Einatmen. Tragen Sie einen Abzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung sowie einer Gesichtsmaske ein. Stellen Sie frisches 4 % PFA her, verdünnt in PBS (~7 ml pro 96-Well-Platte erforderlich).
- Waschen und aspirieren Sie die Zellen mit 200 μL RT 1x PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
Anmerkung: Eine Mehrkanalpipette ist eine effiziente Option für die Pipettierschritte.
- Pipettieren Sie 200 μl vorgewärmtes PBS in jede Vertiefung, wickeln Sie die Platte in Folie ein und inkubieren Sie sie 90 Minuten lang bei 65 °C, um die endogene alkalische Phosphataseaktivität zu denaturieren.
- Aspirieren Sie Vertiefungen und waschen Sie die Zellen mit 200 μl kaltem PBS (4 °C). Erneut aspirieren, 200 μl kaltes DDW einwaschen und erneut aspirieren.
- 50 μl des gelösten BCIP/NBT (hergestellt in Schritt 4.1) in jede Vertiefung pipettieren.
- Wickeln Sie die Platte in Folie ein und inkubieren Sie sie bei RT für 2-24 h.
Anmerkung: Konsistent mit der Inkubationszeit zwischen den Durchläufen; Die zeitliche Flexibilität ermöglicht es den Nutzern, Bohrlöcher entweder an Tag 3 oder am folgenden Tag zu fotografieren.
- Nehmen Sie mit einer Lichtmikroskopkamera Fotos von jeder Vertiefung mit einem 4-fach-Objektiv auf und stellen Sie sicher, dass für alle durchgeführten Assays die gleiche Belichtung, der gleiche Weißabgleich und die gleichen Lichteinstellungen verwendet werden.
- Positionieren Sie jede Vertiefung identisch und stellen Sie sicher, dass die Ränder der Vertiefung auf den Fotos nicht sichtbar sind. Speichern Sie Fotos im TIF-Format oder ähnlichem.
Anmerkung: Spezifische Einstellungen variieren je nach Mikroskop, aber die Quantifizierung ist am effektivsten, wenn die Hintergrundbeleuchtung in allen Vertiefungen hoch und gleichmäßig ist (Abbildung 1B).
Tabelle 1: Mengen an Serum und Verdünnungsmittel, die zur Erzeugung von seriellen Verdünnungen von Serum in dreifacher Ausführung erforderlich sind.
kg
kg
Uhr
kg
kg
kg
| Etikett für Verdünnungskaskade | Verdünnung | 3 x Probe (240 μL) + 10 % Puffervolumen (24 μL) | Verhältnis Serum:Medien |
| Verdünnung 1 (D1) | 1/2 | 264 μL Serum 264 μl Medien | 50:50 Uhr |
| Verdünnung 2 (D2) | 1/4 | 264 μL D1 + 264 μL Medien | 25:75 Uhr |
| Verdünnung 3 (D3) | 1/8 | 264 μL D2 +264 μl Medien | 12,5:87,5 |
| Verdünnung 4 (D4) | 1/16 | 264 μL D3 +264 μL Medien | 6.25:93.75 |
| Verdünnung 5 (D5) | Nr. 1/32 | 264 μL D4 +264 μL Medien | 3,13:96,87 |
| Verdünnung 6 (D6) | Nr. 1/64 | 264 μL D5 +264 μL Medien | 1,56:98,44 |
| Verdünnung 7 (D7) | Nr. 1/128 | 264 μL D5 +264 μL Medien | 0,78:99,22 |
| Verdünnung 8 (D8) | Nr. 1/256 | 264 μL D5 +264 μL Medien | 0,39:99,61 |
| Verdünnung 9 (D9) | Nr. 1/512 | 264 μl D7 + 264 μl Medien | 0,2:99,8 |
| Verdünnung 10 (D10) | Nr. 1/2048 | 132 μl D8 + 396 μl Medien | 0,05:99,95 |
| Verdünnung 11 (D11) | Nr. 1/8192 | 132 μl D9 + 396 μl Medien | 0,01:99,99 |
| Verdünnung 12 (D12) | Nr. 1/32768 | 132 μL D10 + 396 μl Medien | 0,003:99,997 |
Tabelle 2: Beispiel für ein 96-Well-Plattenlayout zur Beurteilung naiver Serumproben in Verdünnungen von 1/2 bis 1/512. Höhere Verdünnungen werden in den Assay integriert, wenn eine Probe untersucht wird, von der bekannt ist, dass sie positiv für AAV-NAbs ist (Proben nach der Verabreichung) oder wenn ein höherer Titer erforderlich ist. MO (-C): Nur-Medien-Steuerung. VO (+C): Viren- und Medienkontrolle. mAb: Monoklonaler Antikörper gegen AAV (NAb-Positivkontrolle).
| Serum-Probe #1 | Serum-Probe #2 | Serum-Probe #3 | Mono AB (mAB), Regler und zusätzliche Samples |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 50 ng
Mab | 50 ng
Mab | 50 ng
Mab |
| B | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 5 ng
Mab | 5 ng
Mab | 5 ng
Mab |
| C | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 0.5 ng
Mab | 0.5 ng
Mab | 0.5 ng
Mab |
| D | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | MO (-C) | MO (-C) | MO (-C) |
| E | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | VO (+C) | VO (+C) | VO (+C) |
| F | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | Beispiel
#1
Nr. 1/512 | Beispiel
#1
Nr. 1/512 | Beispiel
#1
Nr. 1/512 |
| G | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | Beispiel
#2
Nr. 1/512 | Beispiel
#2
Nr. 1/512 | Beispiel
#2
Nr. 1/512 |
| H | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | Beispiel
#3
Nr. 1/512 | Beispiel
#3
Nr. 1/512 | Beispiel
>#3
Nr. 1/512 |
