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1. Zubereitung von Wachstumsmedium, Ofloxacin-Lösung und E. coli-Zellbeständen
- Normales Luria-Bertani (LB) Medium: Fügen Sie 10 g/l Trypton, 10 g/l Natriumchlorid (NaCl) und 5 g/l Hefeextrakt in entionisiertes (DI) Wasser hinzu. Sterilisieren Sie das Medium durch Autoklavieren.
- LB-Agarplatten: Fügen Sie 10 g/l Trypton, 10 g/l NaCl, 5 g/l Hefeextrakt und 15 g/l Agar in DI-Wasser hinzu und sterilisieren Sie das Medium durch Autoklavieren. Bei der gewünschten Temperatur (~55 °C) ~30 mL Agarmedium in quadratische Platten (10 x 10 cm) gießen. Trocknen Sie die Platten und lagern Sie sie bei 4 °C.
- Modifiziertes LB-Medium: 10 g/l Trypton und 5 g/l Hefeextrakt in DI-Wasser geben. Sterilisieren Sie das Medium durch Autoklavieren.
- Modifiziertes LB-Medium mit einem Osmolyten: Mischen Sie 2x modifiziertes LB-Medium mit einer 2x Osmolytlösung in gleichen Volumina. Zur Herstellung von 2x modifiziertem LB-Medium 20 g/L Trypton und 10 g/L Hefeextrakt in DI-Wasser zugeben und durch Autoklavieren sterilisieren. Um die 2x Osmolytlösung herzustellen, lösen Sie den interessierenden Osmolyten (2x Menge) in DI-Wasser auf und sterilisieren Sie die Lösung.
Anmerkung: Der interessierende Osmolyt und seine Konzentrationen können mit Hilfe der Phänotyp-Microarray-Screening-Assays bestimmt werden (siehe Protokoll 4). Der getestete Osmolyt und die damit verbundene 2x-Konzentration können jedoch je nach Art der Forschung angepasst werden. Um beispielsweise die Auswirkungen von 1 mM Natriumchlorid zu untersuchen, wäre eine 2x Osmolytlösung eine 2 mM Natriumchloridlösung.
- Ofloxacin-Stammlösung (5 mg/ml): Geben Sie 5 mg Ofloxacin (OFX)-Salz in 1 ml DI-Wasser. Fügen Sie 10 μl 10 M Natriumhydroxid hinzu, um die Löslichkeit von OFX in Wasser zu erhöhen, und sterilisieren Sie die Lösung dann mit einem Filter. Aliquots zubereiten und bei -20 °C lagern.
Anmerkung: Ofloxacin ist ein Chinolon-Antibiotikum, das sowohl für wachsende als auch für nicht wachsende Bakterienzellen weit verbreitet ist14,21. Die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) von OFX für E. coli MG1655-Zellen liegt im Bereich von 0,039–0,078 μg/ml. Beachten Sie auch, dass andere Antibiotika wie Ampicillin und Kanamycin häufig in der Persisterforschung eingesetzt werden. Die Wahl der Antibiotika hängt von der Art der Studie ab.
- E. coli MG1655 Zellbestände: Beimpfen Sie 2 ml normales LB-Medium mit einer einzigen Kolonie in einem 14-ml-Reagenzglas (mit Schnappverschluss) und kultivieren Sie die Zellen in einem Orbitalschüttler bei 250 U/min und 37 °C. Wenn die Zellen die stationäre Phase erreichen, mischen Sie 500 μl der Zellkultur mit 500 μl 50 % Glycerin (steril) in einem kryogenen Fläschchen und lagern Sie es bei -80 °C.
2. Vermehrung von Zellen zur Eliminierung bereits vorhandener Persister
- Um eine Übernachtkultur vorzubereiten, kratzen Sie eine kleine Menge Zellen mit einer sterilen Pipettenspitze aus einem gefrorenen Zellbestand ab (tauen Sie den Glycerinzellstock nicht auf) und inokulieren Sie die Zellen in 2 ml modifiziertem LB-Medium in einem 14-ml-Reagenzglas mit Schnappverschluss. Kultivieren Sie die Zellen in einem Orbitalschüttler bei 250 U/min und 37 °C für 12 h.
- Erste Vermehrung
- Nach 12 Stunden werden 250 μl der Übernachtkultur auf 25 ml frisches modifiziertes LB-Medium in einem 250-ml-Kolben mit Isolierglas, der mit steriler Aluminiumfolie bedeckt ist, überführt.
- Die Zellkultur wird in einem Orbitalschüttler bei 250 U/min und 37 °C gezüchtet, bis die Zellen die mittlere exponentielle Phase (OD600 = 0,5) erreichen.
- Messen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD600) mit einem Mikroplatten-Reader alle 30 Minuten.
- Zweite Vermehrung
- Bei OD600 = 0,5 verdünnen Sie 250 μl Zellkultur aus dem ersten Kolben in 25 ml frisches modifiziertes LB-Medium in einem 250-ml-Kolben mit Blende.
- Die zweite Zellkultur wird in einem Orbitalschüttler bei 250 U/min und 37 °C gezüchtet, bis OD600=0,5 erreicht ist.
- Messen Sie die optische Dichte alle 30 min.
Anmerkung: Eine Übernachtkultur kann eine signifikante Menge an Persisterzellen enthalten. Die oben beschriebene Verdünnungs-/Wachstumszyklusmethode kann verwendet werden, um diese bereits vorhandenen Persister zu eliminieren, bevor die Zellen in Microarrays überführt werden. Ihre Eliminierung kann durch Quantifizierung der Persistergehalte von Übernachtkulturen mit dem in Protokoll 3 beschriebenen Assay validiert werden.
3. Validierung der Eliminierung bereits vorhandener Persisterzellen
- Nach der zweiten Vermehrung (siehe Schritt 2.3) werden 250 μl der Zellkultur (OD600 = 0,5) in 25 ml frischem modifiziertem LB-Medium in einem 250-ml-Isolierkolben verdünnt.
Anmerkung: Für Kontrollen werden 250 μl Übernachtkultur (siehe Schritt 2.1) in 25 ml frischem modifiziertem LB-Medium in einem 250-ml-Kolben mit Blende verdünnt. Vor dem Transfer der Zellen in den Kolben sollte die Zelldichte der Übernachtkultur in einem frischen modifizierten LB-Medium angepasst werden, um OD600 = 0,5 zu erhalten.
- Geben Sie 25 μl OFX-Stammlösung (5 mg/ml) in die Zellsuspension und schütteln Sie den Kolben vorsichtig, um die Assay-Kultur homogen zu machen. Die Endkonzentration von OFX beträgt 5 μg/ml in der Assay-Kultur.
- Inkubieren Sie die Assay-Kultur in einem Orbitalschüttler bei 250 U/min und 37 °C.
- Zu jeder Stunde während der Behandlung (einschließlich 0 h, dem Zeitpunkt vor der Zugabe von OFX in die Assay-Kultur) wird 1 ml der Assay-Kultur aus dem Kolben in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen übertragen.
- Zentrifugieren Sie die Assay-Kultur im Mikrozentrifugenröhrchen bei 17.000 x g für 3 min.
- Entfernen Sie vorsichtig 950 μl des Überstands, ohne das Zellpellet zu stören.
- 950 μl phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in das Mikrozentrifugenröhrchen geben.
- Wiederholen Sie die Waschschritte 3,5-3,7 insgesamt 3x, bis die Antibiotikakonzentration unter der minimalen Hemmkonzentration (MIC) liegt.
- Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 μl PBS-Lösung, was zu einer 10-fach konzentrierten Probe führt.
- Nehmen Sie 10 μl der Zellsuspension und verdünnen Sie sie sechsmal nacheinander in 90 μl PBS-Lösung mit einer runden 96-Well-Bodenplatte.
- 10 μl verdünnte Zellsuspensionen auf antibiotikafreie frische Agarplatten aufbringen. Um die Nachweisgrenze zu erhöhen, werden die restlichen 90 μl der Zellsuspension auf eine frische Agarplatte aufgebracht.
- Die Agarplatten werden 16 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und dann die koloniebildenden Einheiten (KBE) gezählt. Berücksichtigen Sie die Verdünnungsraten bei der Berechnung der Gesamtzahl der KBE in 1 ml Assay-Kultur. Kill-Kurven werden erstellt, indem die logarithmischen KBE-Werte in Bezug auf die Dauer der Antibiotikabehandlung aufgetragen werden.
Anmerkung: Eine 6-stündige OFX-Behandlung ist ausreichend, um eine biphasische Abtötungskurve für E. coli-Zellen zu erhalten. Die Persisterkonzentration vermehrter Zellen (gemessen anhand der KBE-Zahl nach 6 Stunden) sollte signifikant geringer sein als die der Übernachtkultur. Die in Protokoll 2 und 3 beschriebenen Verfahren können je nach Forschungsdesign mit regulärem LB durchgeführt werden.
4. Microarray-Platten-Screenings
- Vorbereitung von Microarray-Zellkulturen
- 250 μl Exponentialphasenzellen werden in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen auf 25 ml frisches modifiziertes LB-Medium übertragen. Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig, um sie homogen zu machen.
Anmerkung: Die Exponentialphasenzellen (OD600 = 0,5) werden aus dem zweiten Vermehrungsschritt erhalten (siehe Schritt 2.3).
- Übertragen Sie die verdünnte Zellsuspension in ein steriles 50-ml-Reservoir.
- Mit einer Mehrkanalpipette werden 150 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung eines Microarrays übertragen, d. h. auf eine 96-Well-Platte, die verschiedene Osmolyte enthält.
Anmerkung: Vertiefungen, die keine Osmolyte enthalten, dienen als Kontrollen.
- Decken Sie den Microarray mit einer gasdurchlässigen Dichtungsbahn ab.
- Inkubieren Sie die Platte in einem Orbitalschüttler bei 37 °C und 250 U/min für 24 h.
Anmerkung: In diesen Experimenten wurden kommerziell erhältliche Platten verwendet, wie z. B. Phänotyp-Microarrays (PM-9 und PM-10), die eine breite Palette von Osmolyten, pH-Puffern und anderen Chemikalien in getrocknetem Zustand in verschiedenen Konzentrationen enthalten. Diese Microarrays liegen in halbflächigen 96-Well-Plattenformaten vor. Das Kulturvolumen sollte je nach Art der verwendeten Platten angepasst werden. Microarrays können auch manuell generiert werden.
- Manuelle Vorbereitung von Microarray-Platten
- Übertragen Sie 75 μl 2x Osmolytlösungen in die Vertiefungen einer halbflächigen 96-Well-Platte.
- 500 μl Exponentialphasenzellen auf 25 mL 2x modifiziertes LB-Medium in einem 50 mL Zentrifugenröhrchen übertragen. Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig, um sie homogen zu machen.
Anmerkung: Die Impfrate wurde angepasst, um mit dem in 4.1 beschriebenen Microarray-Screening-Protokoll übereinzustimmen.
- Geben Sie 75 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung der halbflächigen 96-Well-Platte mit 2x Osmolytlösungen.
- Die Platte in einem Orbitalschüttler bei 37 °C und 250 U/min für 24 h inkubieren.
- Vorbereitung von Persister-Assay-Platten
- Bereiten Sie 25 ml modifiziertes LB-Medium mit 5 μg/ml OFX in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen vor und überführen Sie dieses Medium in ein steriles Reservoir.
- 190 μl modifiziertes LB-Medium mit OFX aus dem Reservoir mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung einer generischen 96-Well-Platte mit flachem Boden (Persister-Assay-Platte) übertragen.
- Nehmen Sie den Microarray aus dem Schüttler (nach 24-stündiger Kultivierung) und übertragen Sie 10 μl Zellkulturen aus dem Microarray in die Vertiefungen der Persister-Assay-Platte, die modifiziertes LB-Medium mit OFX enthält.
- Nehmen Sie 10 μl Zellsuspensionen von der Persister-Assay-Platte und verdünnen Sie sie dreimal seriell in 290 μl PBS-Lösung mit einer 96-Well-Platte mit rundem Boden und einer Mehrkanalpipette.
- Nach der seriellen Verdünnung werden 10 μl aller seriell verdünnten Zellsuspensionen mit einer Mehrkanalpipette auf antibiotikafreie frische Agarplatten aufgebracht.
- Die Persister-Assay-Platte (hergestellt in Schritt 4.3.3) wird in einem Orbitalschüttler bei 37 °C und 250 U/min für 6 h inkubiert, nachdem die Platte mit einer gasdurchlässigen Dichtungsmembran abgedeckt wurde.
- Nach 6-stündiger Inkubation in einem Shaker nehmen Sie die Persister-Assay-Platte heraus und wiederholen Sie die Schritte 4.3.4-4.3.5.
- Die Agarplatten werden 16 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und dann die KBE gezählt. Die KBE-Gehalte vor und 6 h nach der Antibiotikabehandlung ermöglichen die Berechnung der Persisterfraktion in jeder Vertiefung. Die KBE-Zählungen vor der OFX-Behandlung helfen auch bei der Beurteilung der Auswirkungen von Osmolyten und auf die Lebensfähigkeit von E. coli.