1. Messung des Rückgangs der Proteostase im Muskelgewebe mit Hilfe von Polyglutamin-exprimierenden Tieren
HINWEIS: Zwei Methoden können verwendet werden, um den Proteostase-Rückgang in Muskelzellen zu identifizieren: die Bildung von Proteinaggregaten während des Alterns (1.1) und die Messung der Proteotoxizität, die diese Aggregate mit zunehmendem Alter durch das Einsetzen von Lähmungen verursachen (1.2).
- Bildgebung der Bildung von Polyglutamin-Aggregaten im Muskel während des Alterns
Anmerkung: Der altersabhängige Verlauf der Proteinaggregation in den Muskelzellen wird mit Hilfe von Polyglutamin (polyQ)-Wiederholungen abgebildet, die mit einem gelb fluoreszierenden Protein (YFP) fusioniert sind. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung des Stammes AM140 rmIs132[unc-54p::Q35::YFP], aber auch andere Polyglutamin-Variantenstämme können verwendet werden. Das polyQ::YFP-Transgen wird im Muskel unter Verwendung des muskelspezifischen Promotors unc-54 exprimiert. Synchronisierte unc-54p::p olyQ::YFP-exprimierende Tiere werden an Tag 1, 2, 3 und 4 des Erwachsenenalters visualisiert. Zur Visualisierung von unc-54p::p olyQ::YFP-Aggregaten verwenden Sie ein für Fluoreszenz ausgerüstetes Verbundmikroskop oder ein Fluoreszenz-Präpariermikroskop. AM140 ist erhältlich beim Caenorhabditis Genetics Center (CGC) unter: https://cgc.umn.edu/strain/AM140
- An den Bildgebungstagen (Tag 1, 2, 3 und 4 des Erwachsenenalters) wählen Sie 20 Tiere aus und montieren Sie sie auf einen Objektträger mit einem 3%igen Agarose-Pad und einem 5-μl-Tropfen 10 mM Natriumazid (verdünnt in M9-Puffer).
- Nachdem alle Tiere durch Natriumazid immobilisiert wurden (~ 5 Minuten), bilden Sie den gesamten Körper der Tiere mit einer Linse mit 10-facher Vergrößerung ab (Abbildung 1A). Verwenden Sie für die Bildgebung einen FITC-Filter und die gleiche Belichtung für jedes Tier. Objektträger nach der Bildgebung verwerfen.
Anmerkung: Alternativ können YFP-Brennpunkte auch direkt auf Platten quantifiziert werden, aber die Bewegung muss gehemmt werden, indem während des Ritzens ein Kohlendioxidstrom auf die Platte aufgebracht wird. Diese alternative Methode ist am besten geeignet, wenn eine große Anzahl von Erkrankungen untersucht wird.
- Zählen Sie nach der Aufnahme der Bilder die Anzahl der Herde in der Körperwandmuskulatur des gesamten Tieres. Brennpunkte sind hellere punktuelle Signale, die von dem schwächeren löslichen Signal im Hintergrund unterschieden werden können.
- Zeichnen Sie den Verlauf der Akkumulation von YFP-Herden von den Tagen 1, 2, 3 und 4 auf. Zeichnen Sie ein XY-Diagramm, wobei X die Tage des Erwachsenenalters und Y die Anzahl der unc-54p::p olyQ::YFP-Foki darstellt (Abbildung 1B). Die Anzahl der Herde in der Versuchsbedingung (z.B. Gen-Herunterregulierung oder Überexpression) wird mit der von Kontrolltieren verglichen. Führen Sie statistische Analysen zwischen den Gruppen zu jedem Zeitpunkt durch, der für jeden Versuch beobachtet wird.
- Wenn Sie die Foki-Zählung für nur zwei Bedingungen vergleichen, führen Sie zu jedem Zeitpunkt einen unabhängigen Stichproben-t-Test durch.
- Wenn Sie die Anzahl der Brennpunkte für mehr als zwei Bedingungen vergleichen, führen Sie für jeden Zeitpunkt eine Omnibus-Analyse der unidirektionalen ANOVA durch, einschließlich der Daten für alle Bedingungen zu diesem Zeitpunkt. Wenn die Omnibus-ANOVA einen signifikanten p-Wert ergibt (d. h. p < 0,005), führen Sie eine Post-hoc-Analyse mit paarweise unabhängigen Stichproben-t-Tests durch, um die spezifischen Bedingungen zu bestimmen, zwischen denen ein signifikanter Unterschied in den Brennpunkten festgestellt wurde (z. B. für die Gruppen A, B und C vergleichen Sie A & B, A & C und B & C).
2. Messung der Lähmungsraten bei Tieren als Surrogat für die Polyglutamin-Toxizität in Muskelzellen
HINWEIS: Die altersabhängige Zunahme von PolyQ-Aggregaten im Muskel verursacht den Rückgang der Muskelfunktion, die die Fortbewegung antreibt. Dieser Defekt in der Fortbewegung kann durch Messung der fortschreitenden Lähmungsrate bei polyQ-exprimierenden Tieren bestimmt werden. Für den Lähmungsassay werden synchronisierte unc-54p::p olyQ::YFP-exprimierende Tiere an den Tagen 3, 5, 7 und 9 des Erwachsenenalters bewertet. Fügen Sie bei Bedarf zusätzliche Zeitpunkte hinzu, um den Bewertungsbereich so zu erweitern, dass die Auswirkungen genetischer Störungen beurteilt werden können.
- Schauen Sie sich an den Wertungstagen (Tag 3, 5, 7 und 9 des Erwachsenenalters) die 6 cm großen Platten mit 50 Tieren an und notieren Sie die Anzahl der gelähmten Tiere. Gelähmte Tiere vom Teller nehmen. Wenn Tiere vom Teller gekrochen sind oder gestorben sind, sollten sie zensiert werden; Zeichnen Sie das Ereignis auf, damit es in der Analyse berücksichtigt werden kann.
Anmerkung: Ein Tier gilt als gelähmt, wenn keine Bewegung beobachtet wird, nachdem es leichten oder sanften Berührungsreizen ausgesetzt wurde. Die pharyngeale Pumpaktivität wird verwendet, um festzustellen, ob nicht bewegte Tiere lebendig oder tot sind.
- Berechnen Sie am Ende des Experiments die Lähmungsrate für jede Bedingung. Tun Sie dies zu jedem Zeitpunkt, indem Sie den Anteil der gelähmten Tiere durch die Gesamtzahl der Tiere dividieren, die bei dieser Erkrankung beobachtet wurden. Wenn Sie mehrere Platten pro Bedingung und Zeitpunkt beobachten (d. h. Platten replizieren), berechnen Sie das Verhältnis separat für jede Replikation.
- Zeichnen Sie den Verlauf der Lähmungsrate in einem XY-Diagramm (Streudiagramm). X steht für die Tage des Erwachsenenalters und Y für die Lähmungsraten. Die Lähmungsrate von unc-54p::p olyQ::YFP-Tieren wird mit Kontrolltieren verglichen (Abbildung 1C). Durchführung statistischer Analysen zwischen den Gruppen; Behandeln Sie die Studien bei mehreren Studien unabhängig voneinander. Verwenden Sie die Cox-Proportional-Hazards-Regression und den Wald-Test. Die meisten Datenanalysetools, die die Überlebensanalyse unterstützen, unterstützen auch die Cox-Modellierung.
- Transformieren Sie die Daten: Jede Bedingung sollte zwei Spalten haben, eine für die Zeit und eine für das "Ereignis". Fügen Sie zu jedem beobachteten Zeitpunkt eine Zeile mit "0" für jedes gelähmte Tier und einer "1" für jedes zensierte Tier hinzu. Die Gesamtzahl der Reihen sollte der Anzahl der Starttiere auf dem Teller für diese Bedingung entsprechen.
- Führen Sie die Cox-Proportional-Hazards-Modellierung durch, gefolgt vom Wald-Test, gemäß den Anweisungen für die Statistiksoftware. Ein univariates Modell eignet sich für typische Versuchsdesigns. Wenn bei mehr als zwei Bedingungen ein Test mit allen eingeschlossenen Bedingungen ein signifikantes Ergebnis anzeigt (d. h. p < 0,005), können paarweise Tests zwischen den Bedingungen durchgeführt werden, um das spezifische(n) signifikante(n) Paar(e) von Bedingungen zu bestimmen.
Anmerkung: Das Cox-Modell beruht auf der Annahme, dass die Testbedingung(en) die Wahrscheinlichkeit eines Ereignisses proportional über die Zeit modulieren. Das bedeutet beispielsweise, dass das Cox-Modell nicht geeignet wäre, um eine Bedingung, unter der die meisten Tiere am Tag 1 gelähmt sind, mit einer Bedingung zu vergleichen, unter der die meisten Tiere am Tag 9 gelähmt sind. Erweiterungen des Cox-Modells und andere Ansätze zum Vergleich von Anteilen, die zu jedem Zeitpunkt gelähmt sind, stehen für Fälle zur Verfügung, in denen die Annahme der proportionalen Gefahren nicht zutrifft.
