Bakterieller Co-Inkubations-Assay: Eine auf Fluoreszenzmikroskopie basierende Technik zur Visualisierung der intraspezifischen bakteriellen Konkurrenz auf Einzelzellebene

Zusammenfassung

Quelle: Smith, S., et al., Quantifizierung der interbakteriellen Konkurrenz mittels Einzelzell-Fluoreszenzbildgebung. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video zeigt eine auf Fluoreszenzmikroskopie basierende Methode zur Untersuchung der bakteriellen Konkurrenz auf Einzelzellebene. Diese Methode ermöglicht Einblicke in die Struktur und Funktion von Bakteriengemeinschaften.

Protokoll

1. Bakterienstämme koinkubieren

1. Wählen Sie zwei Bakterienstämme für einzellige bakterielle Konkurrenzassays. Hier werden zwei Stämme von V. fischeri verwendet: ein Zielstamm (ES11424) und ein Inhibitorstamm (MJ1125), von dem bekannt ist, dass er den Zielstamm mit Hilfe des Typ-VI-Sekretionssystems auf Chromosom II (T6SS2)1 abtötet, was ein kontaktabhängiger Abtötungsmechanismus ist.
2. Transformieren Sie Stämme mit stabilen Plasmiden, die Gene für verschiedene fluoreszierende Proteine (z. B. GFP oder RFP) kodieren, um Stammtypen am Mikroskop visuell zu unterscheiden. Dabei wird der Inhibitorstamm mit einem GFP-kodierenden Plasmid (pVSV102) und der Zielstamm mit einem dsRed-kodierenden Plasmid (pVSV208) markiert.
3. Beginnen Sie mit Mid-Log-Kulturen für beide Stämme, messen und erfassen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) für alle Proben.
4. Jede Probe wird durch Verdünnung der Kultur mit LBS-Medium auf einen OD₆₀₀ = 1,0 normalisiert, was etwa 10⁹ KBE/ml für V. fischeri entspricht.
5. Mischen Sie die beiden konkurrierenden Stämme in einem Verhältnis von 1:1 basierend auf dem Volumen, indem Sie 30 μl jedes normierten Stammes in ein markiertes 1,5-ml-Röhrchen geben. Vortexen Sie die Mischstammkultur für 1-2 s.
   Anmerkung: In einigen Fällen kann es sinnvoll sein, Kokulturen in unterschiedlichen Verhältnissen zu mischen. Wenn zum Beispiel ein Stamm viel schneller wächst als der andere, kann es notwendig sein, den langsamer wachsenden Stamm mit einem numerischen Vorteil zu starten, um die Konkurrenz zu beobachten. Eine Optimierung kann auch erforderlich sein, wenn OD₆₀₀ nicht für beide Stämme einem ähnlichen KBE/ml-Wert entspricht.
6. Wiederholen Sie Schritt 1.5 für jedes biologische Replikat und jede Behandlung. In dem hier gezeigten Beispiel ergibt sich daraus insgesamt vier Mischstamm-Röhrchen: zwei biologische Replikate mit dem Wildtyp-Inhibitorstamm, der mit dem Zielstamm gemischt ist, und zwei biologische Replikate mit dem Typ-VI-Sekretionssystem-Mutantenstamm, der mit dem Zielstamm gemischt ist.
7. Um sicherzustellen, dass konkurrierende Zellen eine ausreichende Dichte für eine kontaktabhängige Abtötung in der Koinkubation auf dem Agarpad haben, konzentrieren Sie jede Mischkultur 3-fach, indem Sie die Mischkultur in einem Standard-1,5-ml-Zentrifugenröhrchen für 1 Minute bei 21.130 x g zentrifugieren, den Überstand verwerfen und jedes Pellet in 20 μl lbs-Medium resuspendieren. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Probe.
   Anmerkung: Einige Bakterienzellen reagieren empfindlich auf Schäden durch Zentrifugation bei hohem RCF; In solchen Fällen kann die Mischkultur für 3 min bei 4600 x g zentrifugiert werden. Darüber hinaus ist es bei der Quantifizierung der kontaktabhängigen Konkurrenz wichtig, eine ausreichende Zelldichte auf dem Objektträger sicherzustellen, um die Abtötung zu beobachten. In diesem Artikel hatten "überfüllte" Behandlungen, bei denen eine Tötung beobachtet wird, etwa 10 Zellen/20^{μm 2}.

2. Einrichtung der Folie

1. Wenn Sie ein aufrechtes Mikroskop verwenden, platzieren Sie ein ~5 mm² Agarose-Pad auf einem Standard-Objektträger von 1 mm. 2 μl einer Mischkultur auf das Agarose-Pad aufleuchten und ein Deckglas #1,5 (25 mm²) über den Spot legen. Siehe Abbildung 1B.
2. Wenn Sie ein inverses Mikroskop verwenden, sprühen Sie 2 μl einer Mischkultur auf den Deckglasboden #1,5 einer 35-mm-Petrischale und legen Sie ein ~5 mm² Agarose-Pad über den Coinkubationsspot. Legen Sie ein kreisförmiges Deckglas aus 12 mm über das Agarose-Pad. Ein Beispiel finden Sie in Abbildung 1C.
3. Wiederholen Sie die Schritte 2.1 oder 2.2, je nach verwendetem Mikroskopaufbau, für die verbleibenden drei Mischkulturen, so dass vier Objektträger oder Schalen abgebildet werden sollen.
4. Lassen Sie die Folien ca. 5 Minuten auf der Arbeitsplatte liegen, bevor Sie fortfahren. Dadurch können sich Zellen auf dem Agarpad ansiedeln und Bewegungen während des Bildgebungsprozesses eliminiert werden.

3. Fluoreszenzmikroskopie

1. Beginnen Sie damit, sich auf Zellen zu konzentrieren, die weißes Licht (Phasenkontrast oder DIC) verwenden, um die Auswirkungen des Photo-Bleachings zu minimieren. Basierend auf der durchschnittlichen Größe einer einzelnen Bakterienzelle verwenden Sie ein 60-faches oder 100-faches Ölobjektiv.
2. Passen Sie die Belichtungszeit und die Aufnahmeeinstellungen für jeden Kanal so an, dass die Zellen im entsprechenden Kanal mit minimaler Hintergrunderkennung sichtbar sind.
   Anmerkung: Es ist angemessen, unterschiedliche Expositionszeiten für verschiedene Kanäle zu verwenden, aber die gleiche Expositionszeit sollte für alle biologischen Replikate und Behandlungen für einen bestimmten Kanal verwendet werden.
3. Wählen Sie für jede Probe mindestens fünf Sichtfelder (FOV) aus und nehmen Sie Bilder in jedem entsprechenden Kanal mit den Aufnahmeeinstellungen auf (siehe Beispiele in Abbildung 2). Speichern Sie die XY-Punkte aus jedem FOV, damit das gleiche FOV während des endgültigen Zeitpunkts abgebildet werden kann. Die Bildgebung des gleichen FOV zu jedem Zeitpunkt ist notwendig, um den Anteil der Fläche zu bestimmen, der während der Analyseschritte von Ziel- oder Inhibitorzellen eingenommen wird.
   Anmerkung: In diesem Beispiel wird die Fluoreszenz von GFP mit einem Filter mit einer Anregungswellenlänge von 467 - 498 nm und einem Emissionsfilter von 513 - 556 nm detektiert und ist falschgefärbt grün. Die Fluoreszenz von dsRed wird mit einem Filter mit einer Anregungswellenlänge von 542 - 582 nm und einem Emissionsfilter von 603 - 678 nm detektiert und ist falschfarbig magentafarben.
4. Wiederholen Sie nach 2 Stunden den obigen Schritt für jede Probe mit den zuvor gespeicherten XY-Punkten (Abbildung 2).
   Anmerkung: Das Timing der nachfolgenden Bilder muss möglicherweise für Organismen mit unterschiedlichen Wachstumsraten oder Konkurrenzmechanismen optimiert werden.

Ergebnisse

Abbildung 1: Vorbereitung des Agarose-Pads und Aufbau des Objektträgers für Coinkubationsassays. (A) Aufbau für die Herstellung von 2% Agarose-Pads. Fünf Lagen Laborklebeband (grün) werden an zwei Punkten im Abstand von ca. 20 mm um ein Deckglas gewickelt. Als nächstes wird warme 2%ige Agarose in mariner phosphatgepufferter Kochsalzlösung (gelb) zwischen die Klebebandstücke pipett...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Fischer	Tel.: 05-408-129
10 μl Einkanalpipette
1000 μl Einkanalpipette
20 μl Einkanalpipette
200 μl Einkanalpipette
Agarose	Fischer	Nr. BP165-25	Niedrigschmelzende Agarose
Cellvis 35 mm Schüssel	Fischer	NC0409658	#1.5 Abdeckung Glasboden
Chloramphenicol	Sigma	Nr. C0378	Stamm (20 mg/mL in Ethanol); Endkonzentration in Medien (2 μg/mL LBS)
Bildanalyse-Software für Fidschi	BildJ	https://imagej.net/Fiji/Downloads	Open-Source-Software
Fisherbrand Deckgläser: Kreise	Fischer	12-545-81P	#1,5 Deckglas; 12 mm Durchmesser
Kanamycin-Sulfat	Fischer	Nr. BP906-5	Stamm (100 mg/mL in Wasser, Filter sterilisieren); Endkonzentration in Medien (1 μg/mL LBS)
Linsenreinigung Seidenpapier	Fischer	Nr. S24530
Petriplatten	Fischer	FB0875713	steril mit Deckel
Rasierklingen	Fischer	Nr. S65921
Semi-Mikro-Küvetten	VWR	Tel.: 97000-586
Spektralphotometer
Thermo Scientific Gold Seal Mikroskop-Objektträger	Fischer	Tel.: 12-518-100B
Thermo Scientific Richard-Allan Scientific Deckglas	Fischer	Tel.: 22-050-235	#1.5 Deckglas, 25 mm2
Typ F Immersionsöl	Fischer	NC0297589
Aufrechte oder inverse Fluoreszenzmikroskopie mit Kamera und Bildgebungssoftware			Die Bilder in diesem Artikel wurden mit einem Nikon TI-2 inversen Fluoreszenzmikroskop aufgenommen, das mit einer ORCA-Fusion Digital CMOS-Kamera unter Verwendung der NIS-Elements-Software ausgestattet war.
Wirbel
Wasserbad			Wird verwendet, um Agarose vor dem Pipettieren warm zu halten
LBS-Medien
1M Tris-Puffer (pH ~7,5)			50 mL 1 M Stammpuffer (62 mL HCl, 938 mL DI Wasser, 121 g Trizma Base)
Agar Technisch	Fischer	DF0812-17-9	15 g (Nur für Teller hinzufügen)
DI-Wasser			950 mL
Natriumchlorid	Fischer	Nr. S640-3	ca. 20 g
Trypton	Fischer	BP97265	ca. 10 g
Hefeextrakt	Fischer	Artikel-Nr.: BP9727-2	5 g
mPBS (PBS für die Schifffahrt)			Phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit Zusatz von Meersalzen; zur Herstellung von Agarose-Pads
10-fache PBS	Fischer	ICN1960454
Instant-Meersalz aus dem Ozean	Sofortiger Ozean	SS1-160P	Konzentration auf den entsprechenden Salzgehalt einstellen; hier werden 20 PSU verwendet
Sterile Vakuumfiltereinheiten	Fischer	SCGVU01RE	Wird zur Filtersterilisation von mPBS verwendet
Vakuumpumpe			Wird zur Filtersterilisation von mPBS verwendet