Amplifizierter lumineszierender homogener Proximity-Assay: Ein bead-basierter Proximity-Assay zum Screening kleiner Moleküle, die Protein-Protein-Wechselwirkungen hemmen

Zusammenfassung

Quelle: Wang, L. et al., Studien zu Chaperon-Cochaperon-Wechselwirkungen unter Verwendung eines homogenen Bead-basierten Assays. J. Vis. Exp. (2021)

In diesem Video demonstrieren wir den amplifizierten lumineszierenden homogenen Proximity-Assay – einen Bead-basierten Proximity-Assay. Es verwendet homogen große Akzeptor- und Donorkügelchen, die mit zwei Proteinen immobilisiert sind, die dazu neigen, zu interagieren, um potenzielle kleine Moleküle zu screenen, die Proteininteraktionen hemmen.

Protokoll

HINWEIS: Eine Übersicht über dieses Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Expression und Aufreinigung von GST-FKBP51 und GST-FKBP52 (Abbildung 1A)

1. Plasmide
   HINWEIS: Beziehen Sie cDNA-Klone für humanes FKBP51 (Klon-ID: 5723416) und für humanes FKBP52 (Klon-ID: 7474554) vom IMAGE-Konsortium.
   1. Amplifizieren Sie die humane FKBP51-DNA mittels PCR mit Primern (forward; 5'GGATCCATGACTGATGAAGGT-3', reverse; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3'), die BamHI- und XhoI-Überhänge enthalten, und klonen Sie an BamHI / XhoI-Restriktionsstellen in den pGEX6-1-Vektor.
   2. Amplifizieren Sie die humane FKBP52-DNA mittels PCR mit Primern (forward; 5'-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3', reverse; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3'), die EcoRI- und XhoI-Überhänge enthalten, und klonieren Sie in den pGEX6-2-Vektor an EcoRI / XhoI-Restriktionsstellen.
      Anmerkung: Der Aufbau der PCR-Reaktion und die Bedingungen sind in Tabelle 1 und Tabelle 2 dargestellt.
   3. Überprüfen Sie die eingefügte Sequenz und transformieren Sie die Plasmide in die chemisch kompetenten E. coli gemäß dem Herstellungsprotokoll.
2. Proteinexpression und -reinigung
   1. Fügen Sie 25 g Luria-Brühe (LB)-Basis in 1 l destilliertes Wasser hinzu, um die LB-Lösung herzustellen. Autoklavieren Sie es bei 121 °C für 15 min. Nach dem Abkühlen 50 μg/ml Ampicillin zugeben.
   2. Nehmen Sie eine Kolonie von Bakterien, die GST-FKBP51 oder GST-FKBP52 exprimieren, und mischen Sie sie mit 500 μl LB-Lösung in einem 1,5-ml-Röhrchen. Wirbel.
   3. Die Mischung von "1.2.2" in 1 l LB-Lösung in den mit einer Alufolie bedeckten Erlenmeyerkolben geben. Inkubieren Sie den Erlenmeyerkolben im Shaker über Nacht bei 37 °C.
   4. Induzieren Sie die Proteinexpression durch Zugabe von 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) in den Erlenmeyerkolben und setzen Sie die Inkubation für weitere 2 Stunden fort.
   5. Um Zellpellets zu erhalten, zentrifugieren Sie bei 5.000 x g für 15 min. Entfernen Sie den Überstand.
      Anmerkung: Die Zellpellets können bei -20 °C gelagert werden.
   6. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 40 mL PBS und beschallen Sie 3 x 20 s auf Eis. Fügen Sie 1 mM PMSF, 1 mM EDTA und einen Proteasehemmer-Cocktail (1 Tablette) hinzu, um die Proteolyse zu verhindern.
   7. Zentrifugieren Sie die Suspension 30 Minuten lang mit 50.000 x g, um Zelltrümmer zu entfernen, und tragen Sie den Überstand auf die 5-ml-GST-Fallensäule auf.
   8. Nach dem Waschen der Säule mit 30 mL PBS eluieren Sie GST-FKBP51 und GST-FKBP52 mit 5 mL 10 mM Glutathion in PBS.
   9. Konzentrieren Sie die Proteine auf einer 15 mL 10.000 MWCO-Zentrifugationseinheit. Um freies Glutathion zu entfernen, leiten Sie die Konzentrate durch eine PD-10-Säule, die mit 0,5x PBS äquilibriert ist, und geben Sie das Konzentrat erneut auf die Filterzentrifugenvorrichtung.
   10. Sammeln Sie proteinhaltige Fraktionen. Überprüfen Sie die Proteine in SDS-PAGE und passen Sie die Proteinkonzentrationen auf 1 mg/ml an.
       Anmerkung: Die typische Proteinausbeute beträgt 2-5 mg/L Kultur. Das Protein kann bei -20 °C gelagert werden.

2. Kopplung des Hsp90 C-terminalen Peptids an die Akzeptorkügelchen (Abbildung 1B)

1. Hsp90 Peptid Zubereitung
   1. Synthese des Peptids NH 2-EDASRMEEVD-COOH mit zehn Aminosäuren, das den Aminosäuren 714-724 der humanen Hsp90-Beta-Isoform (UniProt-ID: P08238) entspricht, durch einen Peptidsynthesedienst.
   2. Verdünnen Sie das Hsp90-Peptid in PBS auf eine Konzentration von 1 mg/ml.
2. Vorbereitung der Akzeptorraupen
   1. Verdünnen Sie die unkonjugierten Akzeptorkügelchen in PBS auf eine Konzentration von 1 mg/ml und geben Sie sie in ein 1,5-ml-Röhrchen.
   2. Die Wäsche durch Zentrifugation bei 16.000 x g für 15 min durchführen. Den Überstand vorsichtig entfernen.
3. Konjugation
   1. Stellen Sie das Verhältnis zwischen Kügelchen und Peptid auf 10:1 ein. In das 1,5-ml-Röhrchen mit 1 mg Akzeptorperlenpellet (wie oben beschrieben hergestellt) 1 ml PBS (pH 7,4), 0,1 mg verdünntes Peptid, 1,25 μl Tween-20, 10 μl einer 400 mM Lösung von Natriumcyanoborohydrid (NaBH₃CN) in Wasser geben.
      Vorsicht: NaBH₃CN ist giftig; Verwenden Sie einen Abzug und Handschuhe. NaBH₃CN Lösung sollte frisch zubereitet werden.
   2. 24 h bei 37 °C unter durchgehendem Rühren (10-20 U/min) auf einem Rotationsschüttler inkubieren.
4. Reaktionsabschreckung und Perlenwaschen
   1. Geben Sie 20 μl 1 M Tris-HCl-Lösung (pH 8,0) zur Reaktion, um nicht umgesetzte Stellen zu blockieren. 1 h bei 37 °C inkubieren.
   2. Zentrifugieren Sie bei 16.000 x g (oder maximaler Drehzahl) für 15 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Bead-Pellet in 1 mL Tris-HCl-Lösung (100 mM, pH 8,0).
   3. Wiederholen Sie den Waschschritt dreimal.
   4. Nach der letzten Zentrifugation resuspendieren Sie die Kügelchen bei 1 mg/ml in Lagerpuffer (1 mL von 0,5 × PBS mit 0,01 % Natriumazid als Konservierungsmittel). Lagern Sie die konjugierte Akzeptorraupenlösung bei 4 °C lichtgeschützt.
      Vorsicht: Natriumazid ist giftig; Verwenden Sie einen Abzug und Handschuhe.

3. Der Assay, der die Wechselwirkung zwischen GST-FKBP51 oder GST-FKBP52 und dem Hsp90 C-terminalen Peptid untersucht, und die Hemmung mit Verbindungen kleiner molekularer Massen (Abbildung 1C)

1. GST-markierte Proteine, die mit Glutathion-Donorkügelchen interagieren
   1. Richten Sie die Reaktionen in 384-Well-Platten ein.
   2. Bereiten Sie die Lösung vor, die 10 μg/ml der Glutathion-Donorkügelchen in 0,5x PBS, pH 7,4,
      enthält. Anmerkung: Nach längerer Lagerung setzen sich die Kügelchen ab und müssen vortext werden.
   3. Geben Sie GST-FKBP51 oder GST-FKBP52 bis zu einer Endkonzentration von 10 μg/ml.
   Im
   4. Dunkeln bei 25 °C 10 min.
      inkubieren Anmerkung: In diesem Schritt interagieren GST-markierte Proteine mit Glutathion, das an die Kügelchen gebunden ist. Für jede Vertiefung werden 22,5 μl dieser Mischung verwendet. Die Konzentration der Bindungspartner muss empirisch bestimmt werden. Titrieren Sie GST-FKBP51 und GST-FKBP52 und wählen Sie die Konzentration, die das beste Signal liefert.
2. Zugabe von Verbindungen
   1. Führen Sie serielle Verdünnungen von Testverbindungen in DMSO durch.
      Anmerkung: Die verwendeten Konzentrationen betragen typischerweise 10, 30, 100, 300, 1.000 und 3.000 μM.
   2. Geben Sie 0,25 μl DMSO (Negativkontrolle) oder Hsp90 C-terminales Peptid (Positivkontrolle, 30 μM) oder Verbindungen in DMSO in die Ecke jeder Vertiefung der Platte. Verwenden Sie Triplikate für jede Verbindungskonzentration.
   3. Geben Sie 22,5 μl der Lösung, die Glutathion-Donorkügelchen mit GST-markierten Proteinen enthält, in jede Vertiefung
   .
   4. Schütteln Sie den Teller vorsichtig mit der Hand, aber gründlich. Im Dunkeln bei 25 °C 15 min.
      inkubieren Anmerkung: Während dieser Zeit interagieren Verbindungen mit der TPR-Domäne an der Hsp90 C-terminalen Peptidbindungsstelle.
3. Hinzufügung von Akzeptorraupen
   1. Verdünnen Sie die Akzeptorkügelchen mit angehängtem Hsp90 C-terminalem Peptid auf 100 μg/ml in 0,5x PBS.
   2. Geben Sie 2,25 μl verdünnte Akzeptorkügelchen in jede Vertiefung.
   3. Sanft, aber gründlich mischen. Im Dunkeln bei 25 °C 15 min.
      inkubieren Anmerkung: In diesem Schritt werden Donor- und Akzeptorkügelchen durch die Protein-Peptid-Wechselwirkungen in einander gebracht. Das Endvolumen des Reaktionsgemisches beträgt 25 μL. Daher liegen die Endkonzentrationen von Verbindungen im Bereich von 0,1 bis 30 μM.
4. Tafel-Ablesung
   Anmerkung: Lesen Sie das Schild mit einem Tellerlesegerät aus, das auf den entsprechenden Modus eingestellt ist.
   1. Schalten Sie das Gerät ein und öffnen Sie die Software
   2. Wählen Sie das entsprechende Protokoll aus.
   3. Klicken Sie auf Plattenkarte bearbeiten, und wählen Sie das Bohrloch aus, das in der Platte für die Messung verwendet wird.
   4. Klicken Sie auf Weiter, um fortzufahren und das ausgewählte Protokoll auszuführen.
   5. Klicken Sie nach der Messung auf Ergebnisse anzeigen, um die Ergebnisse anzuzeigen.
   6. Exportieren Sie die Daten.

Tabelle 1: PCR-Reaktion für die humane FKBP51- und FKBP52-DNA-Amplifikation

. kg kg kg kg

Reaktionskomponente	Volumen (μL)
PCR-Puffer (5 x Konzentrat)	4
Grundierung nach vorne	1
Umgekehrte Grundierung	1
Plasmid	0,5
dNTP-Mischung (je 10 mM)	0,5
Phusion DNA-Polymerase	0,5
Wasser (DNA-Qualität)	12,5
gesamt	20

Tabelle 2: Thermocyler-Bedingungen für die humane FKBP51- und FKBP52-DNA-Amplifikation.

Bühne	Temperatur (°C)	Zeit	Zyklen
Anfängliche Denaturierung	94	3 Minuten	1
Denaturierung	94	30 Sek.	35
Glühen	56	30 Sek.
Erweiterung	72	ca. 1 min
Letzte Verlängerung	72	5 Minuten	1
Hinweis: Die Deckeltemperatur beträgt 105 °C.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung dieses Protokolls. (A) Expression und Reinigung von GST-FKBP51 und GST-FKBP52. (B) Kopplung des Hsp90 C-terminalen Peptids an die Akzeptorbeads. (C) Assay, der die Wechselwirkung zwischen GST-FKBP51 oder GST-FKBP52 und Hsp90 C-terminalem Peptid untersucht. Hemmung mit Verbindungen mit kleiner Molekülmasse.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
384-Well-Platten	Perkin Elmer	6008350	Assay-Volumen 25 ml
Amicon 10.000 MWCO Zentrifugationsanlage	Millipore	UFC901008	Konzentrat Protein
ampicillin	Sigma	Nr. A0166	Antibiotika
Bakterienschüttler Unimax 1010	Heidolph		Bakterien kultivieren
cDNA-Klone für humanes FKBP51	Quelle: BioScience	Klon-ID: 5723416	pCMV-SPORT6 Vektor
cDNA-Klone für humanes FKBP52	Quelle: BioScience	Klon-ID: 7474554	pCMV-SPORT6 Vektor
Chemisch kompetente E. coli	Invitrogen	C602003	One Shot BL21 Stern (DE3)
Dmso	Supelco	Artikel-Nr.: 1.02952.1000	Verdünnte Verbindungen
DPBS (Englisch)	Gibco	Nr. 14190-144	Lösung vorbereiten
Edta	Calbiochem	344504	Verhindern Sie die Proteolyse während der Beschallung
Glutathion	Sigma	Nr. G-4251	Eluieren Sie GST-markierte Proteine
Glutathion-Donor-Kügelchen	Perkin Elmer	Artikel-Nr.: 6765300	Spenderperle
GST-Fallen-Säule	Cytiva (GE Healthcare)	17528201	Aufreinigung von GST-markierten Proteinen
Isopropyl-β-D-Thiogalactosid	Thermo Fisher Scientific	Nr. R0392	Induktion der Proteinexpression
LB Brühe (Müller)	Sigma	Nr. L3522	Mikrobielles Wachstumsmedium
PCR-Gerät	BIO-RAD	S1000 Thermocycler	Amplifikation/PCR
PD-10 Säule	Cytiva (GE Healthcare)	17085101	Austausch von Lösungen
pGEX-6P-1 Vektor	Cytiva (GE Healthcare)	28954648	Plasmid
pGEX-6P-2 Vektor	Cytiva (GE Healthcare)	28954650	Plasmid
Teller-Lesegerät	Perkin Elmer	EnSpire 2300 Multilabel-Lesegerät	Alpha-Platte lesen
Software für Plattenleser	Perkin Elmer	EnSpire Manager	Software für Plattenleser
Softwareprotokoll für den Plattenleser	Perkin Elmer	Alpha 384-Well Geringes Volumen	Verwenden Sie dieses Protokoll, um die Platte zu lesen
PMSF (Englisch)	Sigma	Nr. P7626	Verhindern Sie die Proteolyse während der Beschallung
Protease-Inhibitor-Cocktail	Sigma	Nr. S8830	Verhindern Sie die Proteolyse während der Beschallung
Natriumazid	Sigma	Nr. 2002	Als Konservierungsmittel
Natriumcyanoborohydrid (NaBH3CN)	Sigma	156159	Aktiviert die Matrix für die Kopplung
Zehn Aminosäuren Peptid NH2-EDASRMEEVD-COOH, entsprechend den Aminosäuren 714-724 der humanen Hsp90 beta-Isoform	Peptid 2.0 inc		Synthese von Hsp90 C-terminalem Peptid
Reagenzglas-Rotator	LABINCO		Machen Sie durchgängiges Rühren
Tris-HCl	Sigma	10708976001	Blockieren Sie nicht umgesetzte Stellen von Akzeptorkügelchen
Tween-20	Sigma	Nr. P1379	Verhindern Sie die Ansammlung von Kügelchen
Ultra-Zentrifuge Avanti J-20 XP	Beckman Coulter		Zentrifuge, um Bakterienzellpellets zu gewinnen
Ultraschall-Zell-Disruptor	Mikroson		Zellen beschallen, um Protein freizusetzen
Unkonjugierte Akzeptorkügelchen	Perkin Elmer	6762003	Akzeptor-Perlen
XCell SureLock Mini-Cell und XCell II Blot Modul	Invitrogen	EI0002	SDB-SEITE