Virus Plaque Assay: Eine Technik zur Messung des infektiösen Herpes-simplex-Virus durch Quantifizierung von Plaques, die in Monolayern von virusinfizierten Zellen gebildet werden

Zusammenfassung

Quelle: Sadowski, L. A. et al. Einwirkung von Herpes-simplex-Viren. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video beschreibt den Virus-Plaque-Assay des infektiösen Herpes-simplex-Virus oder HSV. Die verdünnten Viruspartikel werden in die Monoschicht der Epithelzellen geimpft. Bei der Inkubation bildet das Virus Plaques und wird visuell gezählt, um den infektiösen Virustiter zu bestimmen.

Protokoll

1. Aussaat der Vero-Zellen

1. Am Tag vor Beginn des Plaque-Assays trypsinisieren Sie Vero-Zellen und resuspendieren sie in regulärem Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) und ergänzen Sie sie gemäß der Standard-Zellkulturmethode. Resuspendieren Sie die trypsinisierten Zellen in 10 ml DMEM pro T-75-Kolben der konfluenten Vero-Zellen (~10⁷ Zellen).
   HINWEIS: DMEM wird für Plaque-Assays anstelle von Alpha-MEM verwendet, da es die Zellwachstumsrate leicht verlangsamt und bessere Plaque-Assay-Ergebnisse begünstigt.
2. Zählen Sie die Zellen nach der von Ihnen bevorzugten Methode (z. B. einem Standard-Hämozytometer mit Trypanblau-Ausschluss).
3. Die Zellen werden mit 4 x 10⁶ Zellen/Platte besiedelt; für HSV-2 verwenden Sie 6-Well-Platten mit 2,5 ml DMEM (mit Nahrungsergänzungsmitteln) pro Well; und für HSV-1 verwenden Sie 12-Well-Platten mit 1,25 mL DMEM (mit Zusätzen) pro Well.
   HINWEIS: Die Anzahl der Zellen sollte unabhängig von der verwendeten Platte konstant sein, obwohl die Größe der Vertiefungen für die Genauigkeit des Plaque-Assays von Bedeutung ist. Es ist wichtig, dass die Zellen gleichmäßig verteilt werden, was am effektivsten erreicht werden kann, indem die Platte hin und her bewegt wird, nicht kreisförmig.
4. Lassen Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C/5 % CO₂ in einem befeuchteten Inkubator wachsen.
   HINWEIS: Die Luftfeuchtigkeit wird mit einem Topf mit destilliertem Wasser, das ein Algizid enthält, am Boden des Inkubators aufrechterhalten.

2. Verdünnung der Probe

1. Schließen Sie die Probenverdünnung und die Zugabe des Virus zu den Zellen in einer Laborsitzung ab.
   VORSICHT: HSV-1 und -2 sind für den Menschen infektiös und müssen unter ordnungsgemäßer Biosicherheitseindämmung (BSL-2) gehandhabt werden. Bewahren Sie alle Materialien, die mit dem Virus in Berührung kommen, getrennt auf und desinfizieren Sie sie mit einem quartären Mittel in einer Verdünnung von 1/256 (siehe Materialtabelle), einem Jodophor, einem Bleichmittel oder einem starken ionischen Reinigungsmittel (z. B. SDS), bevor Sie sie aus der Biosicherheitswerkbank nehmen.
2. Am Tag nach der Aussaat der Vero-Zellen verdünnen Sie jede Virusprobe, die mit Plaque angereichert werden soll, seriell in 1x PBS; verwenden Sie in der Regel 10-fache Verdünnungen für die genaueste Nachverfolgung.
3. Nehmen Sie diese Verdünnungen durch ^10-4 (für niedrige Viruskonzentrationen) oder bis ^10-9 (für die Erwartung von Proben mit höheren Titern) vor, wobei mindestens 1 ml jeder Probe für den Plaque-Assay selbst übrig bleibt.
4. Bewahren Sie alle Virusverdünnungen auf Eis auf (nicht länger als 1 Stunde), bis Sie bereit sind, diese verdünnten Virusproben in die Zellen zu geben.

>3. Zugabe von Viren zu den Zellen

1. Entnehmen Sie das Zellkulturmedium mit einer Pipette aus einer oder zwei Vertiefungen.
   HINWEIS: Verwenden Sie keinen Aspirator, da dieser zu viel Flüssigkeit aus der Zellmonoschicht entfernt und die Zellen austrocknet. Ein entscheidender Aspekt ist die Sicherstellung, dass die Zellmonoschicht während des gesamten Experimentverlaufs hydratisiert bleibt. Trocknen die Zellen aus, waschen sie im letzten Schritt die Platte ab und erzeugen unbrauchbare Daten. Verarbeiten Sie daher nur eine oder zwei Vertiefungen gleichzeitig, um diese Möglichkeit zu verringern.
2. Geben Sie die verdünnte Virusprobe (100-400 μl bzw. 50-200 μl Virusprobe werden für 6-Well- bzw. 12-Well-Platten verwendet) vorsichtig tropfenweise in jede Monoschicht und fügen Sie die Tropfen an der Seite jeder Vertiefung hinzu. Wiederholen Sie den Vorgang für alle ein oder zwei Vertiefungen, bis die gesamte Platte mit den zu plaquenden Virusproben gefüllt ist.
   HINWEIS: Wenn Sie die Tropfen in die Mitte der Vertiefung geben, können sich versehentlich Zellen vom Substrat lösen.
3. Schütteln Sie die gesamte Platte vorsichtig von Hand, um sicherzustellen, dass das PBS, das das Virus enthält, die gesamte Monoschicht der Zellen in jeder Vertiefung bedeckt, und legen Sie die Platte dann in einen CO₂ -Inkubator bei 37 °C, damit das Virus adsorbieren kann.
4. Nehmen Sie alle 10 Minuten innerhalb von 1 Stunde die Platte aus dem Inkubator, schütteln Sie sie erneut vorsichtig, um das Virus gleichmäßiger über die einzelnen Vertiefungen zu verteilen, und legen Sie sie dann wieder in den Inkubator.
   HINWEIS: Jedes Experiment bestimmt die Anzahl der Wiederholungen und die verwendeten Verdünnungen. Die Präferenz des Lesers diktiert diese Entscheidung.
5. Um die Möglichkeit zu verringern, dass versehentlich nicht absorbiertes Inokulum gezählt wird, entnehmen Sie die Virusprobe mit 1000 μL Pipettenspitzen aus den Vertiefungen und legen Sie sie in ein Abfallbecherglas.
   HINWEIS: Auch hier wird dieses Verfahren mit jeweils nur einer oder zwei Vertiefungen durchgeführt, um die Hydratation der Zellmonoschicht aufrechtzuerhalten.
6. 2,5 mL einer Methylcelluloseauflage geben (5 % Methylcellulose w/w in 100 mL PBS auflösen, 15 min bei 121 °C und 15 psi in einem Flüssigkeitskreislauf autoklavieren, dann 375 mL DMEM plus 25 mL FBS hinzufügen).
7. Sobald eine ganze Platte eine Auflage enthält, stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator, um das Wachstum zwei Tage lang zu ermöglichen.
   HINWEIS: Wenn das Virus und die Zellen drei Tage lang wachsen gelassen werden, selbst in DMEM plus Nahrungsergänzungsmitteln, kann es zu einem erheblichen Verlust von Zellen in der Monoschicht kommen, wodurch die endgültigen Daten beeinträchtigt werden.
8. Desinfizieren Sie das Abfallbecherglas, in der Regel mit Zusatz von Bleichmittel, einem Jodophor oder einem ähnlichen Viruzid, bevor Sie es aus der Biosicherheitswerkbank nehmen.

4. Färbung von Plaques

1. Nach der zweitägigen Inkubation wird die Methylcellulose-Auflage mit einer Pipette entfernt, wieder eine oder zwei Vertiefungen auf einmal, und in ein Abfallbecherglas gegeben.
2. Geben Sie ~2 ml 1 % Kristallviolett (siehe Materialtabelle) in 50 % Ethanol in jede Vertiefung, um die Plaques zu färben.
   HINWEIS: Es ist nicht unbedingt erforderlich, den letzten Tropfen des Overlays zu entfernen.
3. Inkubieren Sie die Platte mit allen Vertiefungen, die mit dem Fleck gefüllt sind, 30 Minuten lang bei 37 °C. Desinfizieren Sie an dieser Stelle das Abfallbecherglas wie oben in Schritt 3.8.
4. Waschen Sie die Teller kräftig mit Leitungswasser, bis der Abfluss klar ist.
   HINWEIS: Ein sanfter Wasserstrahl ist nicht kräftig genug; Es ist der volle Druck von einer Laborspüle erforderlich.
5. Stellen Sie an dieser Stelle sicher, dass es ungefähr 10-fache Unterschiede in der Anzahl der Plaques in den einzelnen Verdünnungsreihen gibt.
6. Lassen Sie die Platten über Nacht kopfüber trocknen, danach können die einzelnen Platten gezählt werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
12-Well-Platten	Corning	Nr. 3512
6-Well-Platten	Corning	3516
Alpha-MEM	Lonza	12169F
Antibiotikum/Antimykotikum	Gibco	15240096
Kristallviolett	Alfa Aesar	B2193214
DMEM	Gibco	11965092
Dulbecco's PBS (kein Mg++ oder Ca++)	Gibco	14190144
Fötales Kälberserum	Millipore-Sigma	TMS-013-B
L-Alanyl-L-Glutamin (Glutamax)	Gibco	GS07F161BA
Hämazytometer	Thermo Fischer	Tel.: 02-671-54
Methylcellulose	Millipore-Sigma	Tel.: 27-441-0
Quartärer Wirkstoff (Lysol I.C.)	Thermo Fischer	NC9645698
Trypan-Blau	Corning	25900CI
Trypsin	Cytiva	SH30042.01
Vero-Zellen	ATCC	CCL-81

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