Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. TUNEL-Assay
- Euthanasieren Sie Tiere, die klinische Anzeichen einer Chytridiomykose zeigen, und eine gleiche Anzahl von Bd-negativen Kontrolltieren.
- Präparieren Sie Hautproben (Rücken, Bauch- und Oberschenkel) von jedem Tier. Fixieren Sie die Hautproben für 2 h in 4 % v/v phosphatgepuffertem Formaldehyd. Die kurze und gleichmäßige Fixierzeit ermöglicht eine vollständige Fixierung des Gewebes, aber auch eine effektive und genaue immunhistochemische Färbung. Dann auf 80%iges Ethanol umfüllen, bis es zum Trennen eingebettet wird.
- Die Haut zur histologischen Aufbereitung nach Standardmethoden in Paraffinwachs einbetten. Kurz gesagt, das Protokoll sieht wie folgt aus:
- Dehydrieren Sie das Gewebe in einer abgestuften Reihe von Ethanol und reinigen Sie das Ethanol mit Xylol. Betten Sie das Gewebe in Paraffinwachs ein und legen Sie alle drei Hautproben für jede Person in einen Paraffinblock.
- Schnitt der Haut mit einem Mikrotom nach histologischer Standardpräparation. Schneiden Sie das Gewebe seriell bei 5 μm und befestigen Sie es dann auf hydrophilen Glasobjektträgern. Platzieren Sie vier serielle Histosektionen pro Hauttyp und Objektträger. Machen Sie drei Objektträger pro Person mit seriellen Hautschnitten, denken Sie daran, dass auf jedem Objektträger vier Abschnitte jedes Gewebes angebracht sind.
- Färben Sie die Folien in der folgenden Reihenfolge:
- Färben Sie den ersten Objektträger mit Hämatoxylin, gefolgt von einer Eosin-Gegenfärbung (H&E). Diese Folie dient dazu, die Position von Bd-Sporangien in der Haut zu visualisieren.
- Färben Sie den zweiten Objektträger nach einem handelsüblichen TUNEL-Assay zur histologischen Vorbereitung und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, die im Folgenden beschrieben werden.
- Zuerst entparaffinisieren Sie die Gewebeschnitte in einem Coplin-Glas, indem Sie die Objektträger 5 Minuten lang pro Waschgang dreimal mit Xylol waschen und anschließend zweimal 100 % Ethanol pro Waschgang 5 Minuten lang waschen. Anschließend einmal mit 95 % Ethanol für 3 Minuten und dann 70 % Ethanol für 3 Minuten waschen. Mit einer Wäsche PBS für 5 Minuten abschließen.
- Das Gewebe mit frisch verdünntem proteinverdauendem Enzym (Proteinase K in einer Konzentration von 20 μg/ml, verdünnt in PBS) vorbehandeln und direkt auf den Objektträger geben. 15 min inkubieren lassen. Mit zwei Wechseln PBS in einem Coplin-Glas für jeweils 2 Minuten waschen.
- Klopfen Sie die überschüssige Flüssigkeit ab und löschen Sie 3,0 % Wasserstoffperoxid in PBS in einem Coplin-Glas für 2 Minuten bei Raumtemperatur ab. Spülen Sie zweimal mit PBS, jeweils fünf Minuten lang.
- Klopfen Sie die überschüssige Flüssigkeit ab und tragen Sie dann 75 μL/5 cm2 des Gleichgewichtspuffers direkt auf das Gewebe auf dem Objektträger auf. 10 s inkubieren. Klopfen Sie die überschüssige Flüssigkeit um den Schnitt herum ab und tragen Sie 55 μl/5cm2 des funktionierenden terminalen Desoxynukleotidyltransferase (TdT)-Enzyms auf. In einer befeuchteten Kammer 1 h bei 37 °C inkubieren.
- Nach der TdT-Inkubation den Objektträger in ein Coplin-Glas mit Arbeitsstärke-Stopp-/Waschpuffer geben, 15 s lang rühren und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie den Objektträger mit drei PBS-Wechseln für 1 Minute pro Waschgang. Klopfen Sie die überschüssige Flüssigkeit ab.
- Tragen Sie ein auf Raumtemperatur erwärmtes Anti-Digoxigenin-Konjugat (Rhodamin) auf das Gewebe auf, 65 μL/5 cm2. In einer befeuchteten Kammer 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und Lichteinwirkung vermeiden. Waschen Sie mit vier PBS-Wechseln für 2 Minuten pro Waschgang. Klopfen Sie die überschüssige Flüssigkeit ab.
- Zum Schluss fügen Sie dem Objektträger 15 μl 0,5 - 1 μg/ml DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol) in einem Objektträger-Eindeckmedium hinzu, das als Gegenfärbung wirkt. Anschließend mit einem Deckglas abdecken und mit Nagellack oder Gummizement versiegeln. Lassen Sie die Objektträger im Dunkeln trocknen, da der Assay lichtempfindlich ist.
- Färben Sie den dritten Objektträger mit dem TUNEL-Assay und der DAPI-Gegenfärbung, aber verwenden Sie ihn als Positiv- und Negativkontrolle für jede Probe.
HINWEIS: Von den 4 Histosektionen auf den Kontrollobjektträgern sind die ersten 2 positive Kontrollreplikate und die letzten 2 negative Kontrollreplikate.
- Für die Positivkontrollen wird das Gewebe anstelle von Schritt 1.5.2.2 mit DN-Puffer (30 mM Trizma-Base, pH 7,2, 4 mM MgCl2, 0,1 mM DDT) vorbehandelt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren lassen. Lösen Sie dann Dnase I in DN-Puffer für eine Endkonzentration von 0,1 μg/ml auf und tragen Sie es direkt auf den Objektträger auf. 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und dann den Objektträger mit 5 Wäschen dH2O für jeweils 3 Minuten waschen. Tupfen Sie die überschüssige Flüssigkeit ab. Setzen Sie dann den TUNEL-Test wie in Abschnitt 1.5.2.3 beschrieben fort.
- Bei den Negativkontrollen darf das Enzym terminale Desoxynukleotidyltransferase (TdT) nicht zu diesen Proben hinzugefügt werden (wie in Abschnitt 1.5.2.4 beschrieben).
2. Beobachten Sie die TUNEL-Objektträger sofort nach Abschluss des Assays.
- Nehmen Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop in zufälligen Abständen Fotos entlang jedes Hautabschnitts bei 200X auf, wobei Sie Filter sowohl für die Rhodamin-Färbung verwenden, die die apoptotischen Zellen sichtbar macht und rot erscheint, als auch für DAPI, die alle Zellkerne sichtbar macht und blau erscheint, so dass eine Überlagerung von Zellen erzeugt werden kann. Stellen Sie sicher, dass mindestens 100 Zellen pro Hautschnitt und Probe fotografiert werden. Lagern Sie die Objektträger in einer dunklen Mikroskopbox bei -20 °C.
- Zählen Sie Zellen (blau DAPI gefärbt) pro Bild. Stellen Sie sicher, dass mindestens 100 Zellen pro Hautabschnitt gezählt werden. Um 100 Zellen zu erreichen, zählen Sie alle Zellen im Bild. Wenn weniger als 100 Zellen in einem Bild vorhanden sind, zählen Sie ein weiteres Bild, bis mindestens 100 Zellen pro Hautschnitt und Tier erreicht sind.
- Zählen Sie anschließend die Anzahl der TUNEL-positiven Zellen in denselben Bildern (rot Rhodamin gefärbt). TUNEL-positive Zellen, die auf Apoptose und nicht auf Nekrose oder Hintergrund hinweisen, sind Einzelzellen mit klaren Zellrändern (Membranen sind intakt und es gibt keine Lyse). Manchmal schrumpfen die Zellen zu apoptotischen Körpern.
- Lokalisieren Sie die im TUNEL-Assay gezählten Bereiche und analysieren Sie die entsprechenden Regionen auf den H&E-gefärbten Histosektionen. Vergewissern Sie sich, dass die H&E-gefärbten Schnitte den Bd-Infektionsstellen entsprechen, wodurch sichergestellt wird, dass Bd-infizierte Stellen bei der Zählung apoptotischer Zellen im TUNEL-Assay verwendet werden.
