Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE Veterinärprüfungsausschuss überprüft.
1. Tierhaltung und -überwachung
- Halten Sie die Tiere individuell, in einer artgerechten Umgebung mit einem angemessenen Wasser-, Fütterungs- und Reinigungsplan. Kontrollieren Sie die Tiere täglich.
- Es werden adulte Individuen der bedrohten Litoria verreauxii alpina (für den Caspase 3/7-Assay, Abschnitt 4) verwendet, die aus Zuchteinrichtungen in Gefangenschaft gespendet wurden. Halten Sie die Tiere bei 15 - 18 °C auf einem Moos- und Kiessubstrat, besprühen Sie sie täglich mit Umkehrosmosewasser und füttern Sie sie 3 x wöchentlich mit därmenbeladenen Grillen.
- Sammeln Sie einmal wöchentlich Daten über jede Person. Tupfen Sie die Personen auf Bd, wie in Schritt 2.1 beschrieben. Wiegen Sie jedes Tier mit einer Waage auf 0,1 g genau und messen Sie die Länge von Schnauze bis Entlüftung (SVL) mit einem Messschieber auf 0,01 mm genau.
- Nach der Inokulation (wie in Abschnitt 3 beschrieben) sind die Tiere täglich auf klinische Anzeichen einer Infektion (unregelmäßige Hautschuppung, Appetitlosigkeit, Rötung der Beine, Lethargie oder verzögerter Aufrichtreflex) in Übereinstimmung mit den tierethischen Richtlinien zu untersuchen. Tiere einschläfern, wenn klinische Symptome und Morbidität vorhanden sind.
- Euthanasthan mit einer Überdosis Tricain-Methansulfonat (MS222) (0,1 % w/v MS222 auf pH 6 - 7 mit Natriumbicarbonat in gealtertem Leitungswasser). Halten Sie die Tiere 10 Minuten lang in MS222, nachdem alle Bewegungen aufgehört haben und sie keine Reaktion auf Reize zeigen.
2. Testen auf Bd-Infektion
- Abstrich für Bd
- Tupfen Sie jedes Tier mit einem neuen sterilen Viskosetupfer ab (ein Tupfer pro Tier). Verwende die folgende Abstrichmethode: fünfmal auf den Bauchmuskel und fünfmal auf jeden Oberschenkel, jede Seite und jedes Glied. Das sind insgesamt 45 Schläge.
- Drehen Sie den Tupfer während und zwischen den Zügen vorsichtig, um eine effektive DNA-Erfassung zu gewährleisten. Brechen Sie die Tupferspitze in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie sie bis zur Extraktion bei -20 °C.
- DNA-Extraktion und qPCR-Assay
- Extrahieren Sie genomische DNA aus den Tupfern, indem Sie 50 μl eines kommerziell erhältlichen DNA-Extraktionsreagenzes mit 30 - 40 mg 0,5 mm Siliziumdioxidkügelchen hinzufügen. Schlagen Sie die Proben in einem Bead-Beater-Zell-Disruptor bei maximaler Geschwindigkeit für 2 min. Nach dem Schritt des Rührwerks zentrifugieren Sie die Proben 1 Minute lang bei 2.000 x g.
- Die Proben werden 10 Minuten lang bei 100 °C inkubiert und abkühlen gelassen. Zentrifugieren Sie die Proben 3 Minuten lang bei 5.000 x g und überführen Sie dann den Überstand in einzelne 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie ihn bei -20 °C bis zur qPCR
.
- Verwenden Sie die quantitative PCR (qPCR) in Anlehnung an Boyle et al. 2004, um die Infektionslast zu analysieren. Verwenden Sie die folgenden Änderungen:
- DNA-Extraktionsproben 6:100 mit doppelt deionisiertem Wasser verdünnen. Geben Sie 0,7 μl Rinderserumalbumin (BSA) in jede Vertiefung, um eine PCR-Hemmung zu verhindern. Führen Sie jede Probe einzeln aus. Auf jeder Platte wird eine Negativkontrolle (ohne Vorlage) und eine Positivkontrolle mit einer Reihe von Verdünnungsstandards verwendet, um die Zoosporenlast (Infektionslast) abzuschätzen.
3. Inokulation
- Kultur Bd
- Bereiten Sie die Kulturbrühe vor, indem Sie 16 g Trypton, 2 g Gelatinehydrolysat und 4 g Laktose (TGHL) zu 1 l deionisiertem Wasser hinzufügen. Autoklavieren (121 °C für 40 min) und die Brühe abkühlen lassen.
- Inokulieren Sie das Bd-Isolat (in diesem Fall isoliert aus dem Isolat aus New South Wales, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, Passage Nummer 11) in einer TGHL-Bouillon und wachsen Sie 7 Tage lang bei 23 °C, dann übertragen Sie die Bouillonkultur auf TGHL-Agarplatten.
- Um Platten herzustellen, fügen Sie 16 g Trypton, 2 g Gelatinehydrolysat, 4 g Laktose (TGHL) und 10 g bakteriologischen Agar zu 1 l deionisiertem Wasser hinzu und autoklavieren Sie (121 °C für 40 Minuten). Sobald die Mischung kühl genug ist, um sie anzufassen, aber bevor sie sich verfestigt, gießen Sie den TGHL-Agar in Kulturplatten mit einem Durchmesser von 92 mm, so dass sie zu 1/4 bis 1/3 gefüllt sind, in einer biologischen Sicherheitswerkbank der Klasse II.
- Wenn der Agar fest geworden und vollständig abgekühlt ist, inokulieren Sie jede Platte mit 0,5 ml Bd aus der flüssigen Brühe und verteilen Sie sie gleichmäßig. Die Brühemischung Bd ca. 1 h auf einem Teller trocknen lassen und dann die Platten mit einer Paraffinfolie verschließen. Inkubieren Sie die Platten mit der Agarseite nach unten bei 23 °C für 5 - 7 Tage.
- Flutplatten für Zoospore-Impflösung
- Überprüfen Sie die Motilität der Zoosporen täglich vor der Inokulation unter einem Mikroskop des inversen Lichts, um die Lebensfähigkeit sicherzustellen. Wenn die Zoosporenfreisetzung hoch ist und viele Zoosporen außerhalb der Sporangien schwimmen, ist die Kultur bereit für die Impfung.
- Fluten Sie jede Platte mit 3 ml gealtertem Leitungswasser oder künstlichem Teichwasser, indem Sie das Wasser in die Platte gießen und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, damit die Zoosporen in das Wasser gelangen können. Nach der Inkubationszeit die Zoospore-Suspension in einen neuen sterilen Behälter umfüllen.
- Schätzen Sie die Zoosporenkonzentration gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einem Hämozytometer. Sobald die Konzentration der Zoosporensuspension bekannt ist, verdünnen Sie die Suspension mit gealtertem Leitungswasser auf eine Konzentration von 1 x 106 Zoosporen pro 3 ml.
- Tiere impfen
- Jedes Tier wird geimpft, indem 3 ml Inokulummischung in einzelnen 50-ml-Behältern über den Venter gegossen werden. Lassen Sie das überschüssige Inokulum am Boden des Impfbehälters sammeln. Lassen Sie jedes Tier 24 Stunden lang in einem einzelnen Impfbehälter, um eine Infektion zu gewährleisten, und bringen Sie nach der 24-stündigen Impfung jedes einzelne Tier in ein desinfiziertes Terrarium zurück.
- Desinfizieren Sie die Terrarien mit einer handelsüblichen Bleichlösung mit 13 Vol./Volumenprozent (v/v), spülen Sie sie mindestens zweimal mit Wasser ab und lassen Sie sie dann mindestens 24 Stunden trocknen.
- Bei Bd-Negativkontrollen werden die Tiere mit den gleichen Methoden wie in 3.2 - 3.3 simuliert, aber Bd-freie Agarplatten werden mit 5 mL gealtertem Leitungswasser anstelle von Bd-geimpften Agarplatten geflutet
.
4. Caspase 3/7 Assay
- Sammeln Sie einmal wöchentlich bis Woche 3 nach der Impfung und vierzehntägig bis zum Ende des Versuchs Zehenspitzen von jedem Tier (sowohl Bd-exponiert als auch Bd-negativ), bis zu 8 Zehen pro Individuum.
- Schneiden Sie die Zehenspitze am zweiten Fingerglied mit einer flammsterilisierten Schere ab, geben Sie sie in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen und frieren Sie sie sofort bei -80 °C ein.
- Extrahieren Sie Proteine aus einer gefrorenen Zehenprobe.
- Legen Sie die Proben in 100 μl Probenpuffer (25 mM HEPES pH 7, 5 mM MgCl2) mit zwei Edelstahlperlen (3,2 mm) in ein 1,5 mL Mikroröhrchen mit Schraubverschluss. Die Proben werden in 4 Zyklen von 1 Minute Bead-Schlagen bei maximaler Geschwindigkeit (in demselben Bead-Beater wie in Schritt 1.2.1) und anschließend 3 min auf Eis lysiert. Nach der Lyse die Proben bei 12.000 x g und 4 °C für 5 min zentrifugieren. Sammeln Sie den Überstand zur Verwendung im Assay.
- Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration pro Probe mit dem Bradford-Assay.
- In einer 384-Well-Platte 10 μl Proteinextrakt mit 10 μl Bradford-Reagenz mischen und 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Führen Sie jede Probe in doppelter Ausführung zusammen mit einer Reihe von 5-fachen BSA-Verdünnungsstandards durch. Lesen Sie die Extinktion bei 595 nm auf einem Absorptionsplatten-Reader ab.
- Alternativ, wenn die Zehenspitzenproben zu klein sind (die Proteinkonzentration liegt nahe dem niedrigsten Standard, der mit dem Bradford-Assay bestimmt wurde, oder wenn die beprobten Frösche weniger als 3 g Gesamtgewicht haben), standardisieren Sie die Proben, indem Sie die Hautoberfläche anhand von Fotos anstelle des Bradford-Assays schätzen.
- Bevor Sie die Proteine aus der Probe für den Caspase-Assay extrahieren, fotografieren Sie jeden Zeh bei 40-facher Vergrößerung mit einem inversen Lichtmikroskop.
- Analysieren Sie die Zehenprobe mit Hilfe einer Computerbildgebungssoftware, indem Sie den Bereich der Zehe schätzen. Zeichnen Sie dazu eine Linie um die Kante des Zehenclips und lassen Sie die Bildgebungssoftware den Bereich innerhalb der Form schätzen. Multiplizieren Sie dann diese Fläche mit pi (3.14), was der Oberfläche der 3-dimensionalen Hautprobe entspricht (da Länge x Querschnittsfläche (pi x Durchmesser) die äußere Oberfläche eines Rohrs ergibt).
- Führen Sie den Caspase 3/7-Assay durch.
- Geben Sie in eine 384-Well-Lumineszenzplatte 10 μl handelsübliches Caspase 3/7-Reagenz und 10 μl Proteinextrakt. Führen Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung durch.
- Mischen Sie die Reagenzien, indem Sie die Platte 15 s lang langsam schütteln und die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubieren. Messen Sie die Lumineszenz mit einem Lumineszenzplatten-Reader.
