Der Phagozytose-Assay: eine Immunfärbetechnik zur Visualisierung des apoptotischen Zellengulfments in den embryonalen Zellen von Drosophila melanogaster

Zusammenfassung

Quelle: Nonaka, S. et al. Phagozytose-Assay für apoptotische Zellen in Drosophila-Embryonen. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video demonstriert eine Immunfärbetechnik, um die apoptotische Zellverschlingung in den homogenisierten embryonalen Zellen von Drosophila melanogaster sichtbar zu machen. Diese Methode ermöglicht Einblicke in die zelluläre Physiologie, indem sie das Ausmaß des apoptotischen Zellengulfments bestimmt.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Färbung von Hämozyten

1. Immunfärbung mit einem Anti-Croquemort-Antikörper
   1. Die Objektträger werden 10 Minuten lang nacheinander in Methanol, 10 Minuten lang in PBS mit 0,2 % (v/v) Triton X-100 und anschließend 10 Minuten lang in PBS eingeweicht.
   2. 20 μl 5 % (v/v) Schweinevollkornserum in PBS mit 0,2 % (v/v) Triton X-100 auf Zellen zur Blockierung aufsetzen. Inkubieren Sie die Objektträger 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.
   3. Entfernen Sie die Lösung von den Objektträgern und binden Sie 20 μl Anti-Croquemort-Antiserum (0,1 % (v/v)) in PBS mit 0,2 % (v/v) Triton X-100 auf die Zellen. Die Objektträger über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   4. Laschen Sie Objektträger 5 Mal 10 Minuten lang in PBS mit 0,2 % (v/v) Triton X-100.
   5. Objektträger 10 Min. in PBS einweichen.
   6. 20 μl alkalisches Phosphatase-markiertes Anti-Ratten-IgG (0,5 % (v/v)) in PBS mit 0,2 % (v/v) Triton X-100 und 5 % (v/v) ganzem Schweineserum werden 1 h lang bei Raumtemperatur auf Zellen aufgebracht.
   7. Laschen Sie Objektträger 5 Mal 10 Minuten lang in PBS mit 0,2 % (v/v) Triton X-100.
   Die
   8. Objektträger werden 10 Minuten lang in einem Puffer mit 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl und 50 mM MgCl2 eingeweicht.
   9. Mount Phosphatase-Substratlösung, die 0,23 mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (BCIP), 0,35 mg/ml Nitroblau-Tetrazolium (NBT), 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl und 50 mM MgCl₂ auf Zellen enthält.
   10. Beobachten Sie die Zellen unter einem Mikroskop, um sie richtig zu färben. Wenn starke violette Signale im Granulat der Hämozyten auftreten, entfernen Sie die Substratlösung und weichen Sie die Objektträger in einem Puffer ein, der aus 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 und 1 mM EDTA besteht. Es wird empfohlen, die Färbung für ca. 5 - 10 min
   zu halten.

2. Apoptotische Zellen mit TUNEL färben

1. Objektträger 5 Min. in PBS einweichen.
2. Wiederholen Sie dies mit dem neuen PBS.
3. Äquilibrierungspuffer (siehe Materialtabelle) für 10 min auf Zellen montieren.
4. Nehmen Sie die Lösung von den Objektträgern und binden Sie 20 μl TdT-Lösung mit 5 μl terminaler Desoxynukleotidyltransferase und 15 μl Reaktionspuffer 1 h lang bei 37 °C auf die Zellen.
5. Entfernen Sie die Lösung von den Objektträgern und weichen Sie die Objektträger in einem Puffer ein, der aus 0,5 mL STOP/Wash-Puffer und 17 mL Wasser besteht.
6. Weichen Sie die Dias 3 Mal 5 Minuten lang in PBS ein.
7. Montieren Sie 20 μl Anti-Digoxigenin-Peroxidase 30 Minuten lang auf Zellen bei Raumtemperatur.
8. Weichen Sie Objektträger 4 Mal 5 Minuten lang in PBS ein.
9. Die Objektträger werden 30 s lang in einer Peroxidase-Substratlösung eingeweicht, die aus 30 mL 50 mM Tris-HCl, pH7,5 besteht und einen vollen Mikrospatel aus 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrichlorid (DAB) und 0,002 % (v/v) H₂O₂ enthält.
10. Wiederholen Sie den obigen Schritt, bis die apoptotischen Zellen braun gefärbt sind. Weichen Sie Objektträger in Wasser ein, um die Peroxidase-Reaktion zu stoppen.
11. Umschließen Sie die Zellen zur Beobachtung mit Wasser.

3. Messen Sie den Grad der Phagozytose apoptotischer Zellen

1. Betrachten Sie die Proben unter einem Lichtmikroskop, um den Grad der Phagozytose zu beurteilen. Zählen Sie Croquemort-positive Zellen oder GFP-positive Zellen als Hämozyten, TUNEL-positive Zellen als apoptotische Zellen und doppelt positive Zellen als phagozytierende Hämozyten.
2. Der phagozytäre Index ist definiert als die Anzahl der doppelt-positiven Zellen im Verhältnis zur Gesamtzahl der Croquemort-positiven Zellen oder GFP-positiven Zellen. Es wird empfohlen, mehr als 300 Hämozyten zu beobachten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Serum für ganze Schweine	MP Biomedizin	Artikel-Nr.: 55993	Zum Blockieren
Kpl Anti-Ratte IgG (H+L) ab MSA, AP	KPL	Nr. 475-1612	Sekundärantikörper zur Färbung von Hämozyten mit einem Anti-Croquemort-Antikörper
5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat	Roche	11383221001	BCIP, Zur Färbung von Hämozyten
Nitroblau, Tetrazolium	Roche	11383213001	NBT, Zur Färbung von Hämozyten
Anti-Croquemort-Antikörper			zuvor beschrieben in Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
Apop Tag Peroxidase In-situ-Apoptose-Nachweiskit	Millipore	Nr. S7100	Zur Färbung von apoptoitschen Zellen. Dieses Kit enthält einen Äquilibrierungspuffer, einen Reaktionspuffer, einen STOP/Wash-Puffer, ein TdT-Enzym und eine Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
3,3'-Diaminobenzidintetrahydrichlorid	Nacalai Tesque	Nr. 11009-41	DAB, Zur Färbung von apoptoitschen Zellen