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Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
1. Kultur und Vorbereitung der THP-1-Monozyten-Zelllinie
- Kultur von THP-1-Monozyten als Suspensionskultur in T25-Kolben bei 37 °C + 5 % CO2. Die Zellen sollten in 5 ml Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10 % fötalem Rinderserum (FBS) gezüchtet werden.
- Suspendieren Sie die Zellen jeden Tag gleichmäßig durch leichtes Schütteln des Kolbens und zählen Sie die Zellen sofort mit einem Hämozytometer. Die Zellen sollten durchgelassen werden, sobald die Zelldichte 1 x 106 Zellen/ml erreicht:
- RPMI 1640 + 10% FBS in einem 37 °C warmen Wasserbad vorwärmen.
- 2 x 105 Zellen werden in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen oder ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt und die Zellen durch Zentrifugieren bei 500 x g bei Raumtemperatur für 5 min gekrönt.
- Entfernen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören, und resuspendieren Sie das Pellet in 1 mL (1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen) oder 5 mL (15 mL konisches Röhrchen) mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 500 x g bei Raumtemperatur für 5 min. Entfernen Sie das PBS, ohne das Küvettenpellet zu stören.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml frischem RPMI 1640 + 10 % FBS.
- In einen neuen T25-Kolben werden 4 ml erwärmtes Medium gegeben und die resuspendierten Zellen aus Nummer 1.2.5 zugegeben. Kultivieren Sie in einem Inkubator mit 37 °C + 5 % CO2, bis die Zellen passagiert werden müssen (in der Regel 3 Tage) oder bis die Zellen für ein Experiment benötigt werden.
- Für ein Experiment mit THP-1-abgeleiteten Makrophagen wird die erforderliche Anzahl von Zellen vor dem Passieren aus dem Kolben und der Platte entfernt:
- Platzieren Sie die erforderliche Anzahl von 18 mm kreisförmigen Glasdeckgläsern (#1,5 Dicke) in den Vertiefungen einer 12-Well-Platte – in der Regel 1 Deckglas pro Bedingung und/oder Zeitpunkt. In jede Vertiefung aliquotieren 5 x 104 THP-1 Monozyten. Die Anzahl der Zellen, die jeder Vertiefung hinzugefügt werden, kann bei Bedarf geändert werden.
- Erhöhen Sie das Gesamtvolumen jeder zellhaltigen Vertiefung auf 1 ml mit RPMI + 10 % FBS, erwärmt auf 37 °C.
- Geben Sie 100 nM Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA) in jede Vertiefung und kultivieren Sie sie 3 Tage lang, um die Differenzierung von THP-1-Monozyten in Makrophagen-ähnliche Zellen zu induzieren.
2. Kultur und Präparation der J774.2 Makrophagen-Zelllinie
- J774.2-Zellen in T25-Kolben bei 37 °C + 5 % CO2 kultivieren. Die Zellen sollten in 5 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + 10 % FBS gezüchtet und passageiert werden, sobald die Kultur eine Konfluenz von 80-90 % erreicht hat. Zu den Durchgangszellen:
- Nehmen Sie alle Medien aus dem Kolben und gehen Sie einmal mit 5 mL PBS auf.
- PBS aus dem Kolben nehmen und durch 5 ml frisches DMEM + 10 % FBS ersetzen.
- Kratzen Sie mit einem Zellschaber den Boden des Kolbens ab, um die Zellen im Medium aufzuhängen. Pipettieren Sie die Zellen mehrmals kräftig, um eventuelle Zellaggregate aufzubrechen.
- Die Zellen werden im Verhältnis 1:5 verdünnt, indem 4 ml der Zellsuspension aus dem Kolben entnommen und durch 4 ml frisches Medium ersetzt werden. Die verbleibende Zellsuspension kann verworfen, zum Starten einer neuen Zellkultur in einem frischen T25-Kolben verwendet oder für ein Experiment verwendet werden.
- Zur Vorbereitung eines Efferozytose-Assays mit J774.2-Zellen:
- Einen Tag vor Beginn des Experiments werden J774.2-Zellen gemäß den Schritten 1.1.1 bis 1.1.3 in 5 ml frischem Medium suspendiert. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und bereiten Sie das erforderliche Zellvolumen in einer Konzentration von 5 x 104 Zellen/ml vor.
- Legen Sie die erforderliche Anzahl von 18 mm kreisförmigen Glasdeckgläsern (#1,5 Dicke) in die Vertiefungen einer 12-Well-Platte. In jede Vertiefung aliquotieren Sie 1 mL der 5 x 104 Zellen/ml Zellsuspension.
- Über Nacht kultivieren, damit die Zellen am Deckglas haften und sich von der Passage erholen können.
3. Kultur von primären menschlichen M2-Makrophagen
- Sammeln Sie 10 ml heparinisiertes menschliches Blut für jede benötigte 12-Well-Platte mit M2-Makrophagen.
- In einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen werden 5 ml menschliches Blut auf 5 ml vorgewärmtes Lympholyt-Polyzell-Trennmedium gelegt. Bereiten Sie mehrere Röhrchen vor, wenn Sie >5 ml Blut verarbeiten, anstatt Röhrchen mit größerem Volumen zu verwenden.
- Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 35 min mit mittlerer Beschleunigung und ohne Pause.
- Entfernen Sie vorsichtig die obere mononukleäre zellreiche Bande mit einer Kunststoffpipette und geben Sie sie in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Wenn in Schritt 3.2 mehrere Röhrchen vorbereitet wurden, können die Banden in einem einzigen 50-ml-Röhrchen zusammengefasst werden. Bringen Sie das Volumen des Röhrchens mit PBS auf bis zu 50 ml.
- Bei 300 x g für 8 min zentrifugieren und den Überstand entfernen. Legen Sie während dieses Schritts autoklavierte kreisförmige Deckgläser mit einem Durchmesser von 18 mm (#1,5 Dicke) in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 300 μl serumfreiem RPMI 1640 pro gewünschter Anzahl von Wells; Wenn z. B. 10 ml Blut verarbeitet wurden, um eine vollständige 12-Well-Platte herzustellen, suspendieren Sie das Zellpellet in 3,6 ml Medium.
- Geben Sie 300 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung mit Deckglas in der 12-Well-Platte. 1 h bei 37 °C + 5 % CO2 inkubieren.
- Waschen Sie den Deckbezug vorsichtig 3x mit 1 ml erwärmtem PBS, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen.
- Fügen Sie 1 ml RPMI 1640 + 10 % FBS + 10 ng/ml rekombinantes humanes M-CSF + Zellkultur-Antibiotikum/Antimykotikum hinzu. Bei 37 °C + 5 % CO2 5 Tage inkubieren.
- Ersetzen Sie das Medium durch RPMI 1640 + 10 % FBS + 10 ng/ml rekombinantes humanes M-CSF + 10 ng/ml rekombinantes humanes IL-4 + Zellkultur-Antibiotikum/Antimykotikum. Inkubieren Sie 2 Tage lang bei 37 °C + 5 % CO2, um die M2-Polarisation abzuschließen.
- Polarisierte Makrophagen sollten innerhalb der nächsten 3 Tage verwendet werden.
4. Präparation apoptotischer Jurkatzellen
- Kultur von Jurkat-Zellen in 5 mL RPMI 1640 + 10 % FBS bei 37 °C + 5 % CO2. Jurkats sind eine Suspensionszelllinie und können gepflegt werden, indem sie alle 3–5 Tage 1:5 in frische, vorgewärmte Medien gegeben werden.
- Um apoptotische Zellen vorzubereiten, lassen Sie die Jurkat-Kultur auf eine hohe Dichte heranwachsen (4–5 Tage nach der Passage). Aliquotieren Sie 1,5 mL in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 500 x g für 5 min.
- Überstand verwerfen und Zellpellet in 1 ml serumfreiem RPMI 1640-Medium mit 1 μM Staurosporin resuspendieren.
- 16 h bei 37 °C + 5 % CO2 inkubieren, um die Zellen apoptotisch zu machen.
- Falls gewünscht, bestätigen Sie die Induktion der Apoptose durch Färbung mit Annexin V:
- Aliquotieren Sie 100 μl der mit Staurosporin behandelten Jurkat-Zellkultur in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Pelletzellen durch Zentrifugation bei 500 x g für 5 min, Überstand verwerfen und Zellpellet in 100 μl serumfreiem RPMI 1640-Medium resuspendieren.
- 1 μl Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-konjugiertes Annexin V zugeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
- Fügen Sie 900 μl PBS hinzu und übertragen Sie das gesamte Volumen in eine einzelne Vertiefung einer 12-Well-Platte, die ein 18 mm kreisförmiges Glasdeckglas (#1,5 Dicke) enthält. In einer Zentrifuge, die mit einem Plattenadapter ausgestattet ist, 1 Minute lang bei 200 x g drehen, um die Zellen zum Anhaften am Deckglas zu zwingen. Alternativ können die Zellen zur Bildgebung in einen Objektträger mit Kammer gelegt werden.
- Aufnahme mit einem Fluoreszenzmikroskop.
5. Quantifizierung der efferozytären Aufnahme und Dynamik mit einem festen Zell-Efferozytose-Assay und Inside-Out-Färbung
- Bereiten Sie THP-1-, J774.2- oder M2-Makrophagen vor, wie in den Abschnitten 1 bis 3 beschrieben.
- Bereiten Sie am Abend vor Beginn des Experiments apoptotische Jurkat-Zellen vor, wie in Abschnitt 4 beschrieben.
- Unmittelbar vor dem Experiment werden apoptotische Zellen mit einem Hämozytometer gezählt. Übertragen Sie eine ausreichende Anzahl apoptotischer Zellen in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen – in der Regel fügen wir 5 x 105 Zellen/Vertiefung hinzu, was ein Ziel:efferozyten-Verhältnis von 10:1 ergibt.
- Pelletieren Sie Jurkat-Zellen durch Zentrifugation bei 500 x g für 5 min und resuspendieren Sie sie in 500 μl PBS.
- Während der Zentrifugation aliquotieren Sie 10 μl DMSO in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Lösen Sie im DMSO eine minimale Menge N-Hydroxysuccinimidobiotin (NHS-Biotin) auf. 5-10 Kristalle (~0,005 mg) sind ausreichend.
- Übertragen Sie die 500 μl apoptotische Zelle/PBS-Suspension in das DMSO/NHS-Biotin-haltige Röhrchen. Verdünnen Sie dann einen Zellverfolgungsfarbstoff auf die vom Hersteller empfohlene Konzentration in der apoptotischen Zellsuspension. Achten Sie darauf, dass Sie einen Zellverfolgungsfarbstoff auswählen, der sich spektral nicht mit FITC-Streptavidin überschneidet (z. B. roter oder dunkelroter Zellverfolgungsfarbstoff).
- Die Suspension 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Geben Sie das gleiche Volumen RPMI 1640 + 10 % FBS hinzu und inkubieren Sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln, um nicht umgesetzte Farbstoffe zu löschen.
- Pelletzellen durch Zentrifugation bei 500 x g für 5 min, den Überstand verwerfen und die gefärbten apoptotischen Zellen in 100 μl RPMI 1640 + 10 % FBS pro Vertiefung Makrophagen resuspendieren.
- Geben Sie 100 μl gefärbte apoptotische Zellsuspension tropfenweise in jede Vertiefung der Makrophagen. Zentrifugieren Sie 200 x g für 1 min in einer Zentrifuge, die mit einem Plattenadapter ausgestattet ist, um den Kontakt zwischen Makrophagen und apoptotischen Zellen zu erzwingen.
- Inkubieren Sie die Platte für den gewünschten Zeitraum bei 37 °C + 5 % CO2 in einem Gewebekultur-Inkubator. Bei Makrophagen ist efferozytiertes Material in der Regel nach 20–30 min erstmals nachweisbar und nach 120–180 min abgeschlossen.
- Entnehmen Sie zu den gewünschten Zeitpunkten Zellen aus dem Inkubator. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 ml PBS bei Raumtemperatur, um die Efferozytose zu stoppen und nicht efferozytierte apoptotische Zellen zu entfernen.
- FITC-konjugiertes Streptavidin in einer Verdünnung von 1:1.000 in jede Vertiefung geben und 20 Minuten im Dunkeln inkubieren. Dadurch wird das exponierte Biotin auf jeglichem nicht efferozytierten apoptotischen Zellmaterial markiert.
Anmerkung: Falls gewünscht, können Zellkerne während dieses Schritts durch Zugabe von 1:20.000 Verdünnung von Hoechst 33342 oder 4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid (DAPI) gefärbt werden.
- Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit 1 mL PBS und schütteln oder wiegen Sie die Proben 5 Minuten lang pro Spülgang. Fixieren Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 20 min bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Zellen einmal mit PBS, um überschüssiges PFA zu entfernen.
- Montieren Sie Deckgläser auf einem Objektträger für die Bildgebung und übertragen Sie sie an ein Fluoreszenzmikroskop. Erfassen Sie Z-Stacks mit einer ausreichenden Anzahl von Zellen für eine genaue Quantifizierung – in der Regel 10 bis 30 Zellen pro Zustand. Nicht-internalisiertes apoptotisches Zellmaterial wird in dem resultierenden Bild als zellverfolgendes Farbstoff-markiertes Material sichtbar sein, das von FITC-Streptavidin-Färbung umhüllt ist, während efferozytiertes Material diskrete zellverfolgende Farbstoff-Puncta bildet, die frei von jeglicher Streptavidin-Färbung sind.
- Quantifizieren Sie die Efferozytose in den resultierenden Bildern durch eine Vielzahl von Messungen:
- Berechnen Sie den efferozytären Index durch Bestimmung der durchschnittlichen Anzahl diskreter efferosomen (cell tracking dye+/streptavidin-puncta) pro Makrophage. Quantifizieren Sie nur Makrophagen, die an eine apoptotische Zelle gebunden sind oder ≥1 sichtbare Efferosomen enthalten. Erfassen Sie Makrophagen, die an eine apoptotische Zelle gebunden sind, aber keine diskreten Efferosomen haben, mit einem efferozytären Index von 0.
- Berechnen Sie die efferozytäre Effizienz, indem Sie den Anteil der Makrophagen messen, die ≥1-Efferosom enthalten.
- Berechnen Sie die Rate der Efferozytose, indem Sie Zellen abbilden, die zu mehreren Zeitpunkten fixiert und gefärbt wurden. Es werden nur Makrophagen abgebildet, die an apoptotische Zellen gebunden sind oder sichtbare Efferosomen enthalten, wobei von jeder Zelle Z-Stacks erfasst werden. Bestimmen Sie nach der Aufnahme die Rate der Efferozytose:
- Mit der Streptavidin-Färbung als Leitfaden und dem Freihand- oder Polygonauswahlwerkzeug in FIJI/ImageJ (oder einem anderen Bildanalyse-Softwarepaket) kreisen Sie das gesamte Zellverfolgungsfarbstoff+/Streptavidin-Material (z. B. internalisiertes) Material in einer einzigen Ebene des Z-Stapels ein. Messen Sie die integrierte Intensität des zellverfolgenden Farbstoffs in dieser Region. Individuelle Messungen für jedes Efferosom (z. B. Durchmesser, Positionierung relativ zur Zellgrenze oder zum Zellkern usw.) können problemlos gleichzeitig mit diesen Messungen erfasst werden, wodurch die während der Analyse gesammelten Daten erheblich erweitert werden.
- Kreisen Sie auf demselben Z-Schnitt unter Verwendung der Streptavidin-Färbung als Leitfaden und des Freihand- oder Polygonauswahlwerkzeugs das gesamte Zellverfolgungsmaterial Dye+/Streptavidin+ (z. B. nicht internalisiertes Material) in einer einzigen Ebene des Z-Stapels ein. Schließen Sie nur die Färbung von apoptotischen Zellen ein, die mit dem Phagozyten in Kontakt kommen. Messen Sie die integrierte Intensität dieses Bereichs.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.2.3.1 bis 4.2.3.2 für die verbleibenden Z-Abschnitte des Bildes. Summieren Sie die integrierte Intensität des efferozytierten (Σeff) und des nicht efferozytierten (Σne) Materials. Der Anteil der apoptotischen Zelle, der efferozytiert wurde, kann für die Zelle wie folgt berechnet werden:
- Quantifizieren Sie die efferozytierte Fraktion für alle Zellen zu jedem Zeitpunkt. Es ist zu beachten, dass die Fluoreszenzintensität von apoptotischen Zellen/efferosomen zwischen den Bildern variieren kann, da die Aufnahme von Zellverfolgungsfarbstoffen durch einzelne apoptotische Zellen variiert und sich die Bildaufnahmeparameter wie die Belichtungszeit ändern. Vergleichen Sie daher nur normalisierte Werte wie Fraction efferocytosed oder intensitätsunabhängige Werte wie efferozytären Index und efferozytäre Effizienz zwischen Bildern, zwischen experimentellen Bedingungen und zwischen wiederholten Experimenten.
- Um sicherzustellen, dass der resultierende Datensatz die Variation der Efferozytose zwischen den Zellen genau widerspiegelt, führen Sie diese Analysen mit der maximal möglichen Anzahl von Zellen in jedem Experiment durch.
Anmerkung: Die efferozytäre Effizienz und der efferozytäre Index können schnell berechnet werden (einige Sekunden/Zelle), und wir streben in der Regel an, mindestens 100 Zellen pro Experiment zu analysieren und jedes Experiment mindestens 3 Mal zu wiederholen. Die Berechnung des Anteils des efferozytierten Materials und efferosomenspezifische Messungen sind mühsamer und dauern in der Regel 2–3 Minuten/Zelle für einen erfahrenen Analytiker. Für diese Berechnungen quantifizieren wir mindestens 15 Zellen pro Bedingung und Experiment.
- Erfassen Sie den efferozytären Index, die efferozytierte Fraktion und individuelle Efferosomendaten pro Zelle.
Anmerkung: Dies ermöglicht die Datenanalyse mit Einzelzellansätzen, wodurch Variationen zwischen den Zellen quantifiziert werden können. Analysen auf Populationsebene können weiterhin an diesen Datensätzen durchgeführt werden, indem Einzelzelldaten, die in einzelnen Experimenten gewonnen wurden, gemittelt werden. Efferosomenspezifische Messungen können auf Populationsebene, auf Einzelzellebene und als Ensembles (z. B. als Populationen von Efferosomen unabhängig von den Zellen, die sie enthalten) analysiert werden.