Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE Veterinärprüfungsausschuss überprüft.
1. Vorbereitung der Medien
- Fügen Sie alle Komponenten, wie in Tabelle 1 beschrieben, hinzu, um das grundlegende Eizellentnahmemedium und das Eizellreifungsmedium herzustellen. Stellen Sie für das basische Sammelmedium den pH-Wert auf 7,4 ein. Sowohl für das Entnahme- als auch für das Reifungsmedium sind am Tag der Anwendung 3 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) und 1 μM Cilostamid zuzugeben.
2. Vorbereitung von mRNA, die für Ypet-3' UTR und mCherry kodiert
- Ermitteln Sie die 3'-UTR-Sequenzen der interessierenden mRNAs.
Anmerkung: Für diese Studie wurden zuvor Sequenzen aus der cDNA von Eizellen der Maus gewonnen.
- Entwerfen Sie Primer zur Amplifikation der Ziel-3'-UTRs aus der cDNA der Eizelle und Teilen des pcDNA 3.1-Vektors, die eine Ypet-kodierende Sequenz, einen V5-Epitop-Tag und einen T7-Promotor enthalten.
- Amplifizieren Sie mit einem High-Fidelity-DNA-Polymerase-Kit. Lassen Sie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Produkte auf einem Gel laufen, um zu überprüfen, ob die Fragmente die richtige Größe haben, schneiden Sie die Banden aus und extrahieren Sie die DNA aus dem Gel mit einem Gel-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Fusion der PCR-Fragmente mit einem PCR-Klonierungskit zu einem Vektor.
Anmerkung: PCR-Fragmente wurden 4 Stunden lang auf Eis inkubiert, um einen effizienteren Rekombinationsprozess zu ermöglichen. Dies steht im Widerspruch zu den Angaben des Herstellers, der eine Inkubationszeit von nur 45 min empfiehlt.
- Transfizieren Sie PCR-Fragmente in kompetente 5-α Escherichia coli-Bakterien.
- Die Mischung und das Plasmid zu den Bakterien geben und 30 Minuten auf Eis inkubieren.
- Die Mischung und das Plasmid durch Hitzeschock behandeln, indem die Mischung 45 s lang bei 42 °C in ein Wasserbad gelegt und sofort 3 Minuten lang auf Eis abgekühlt wird.
- 500 μl Super Optimal-Bouillon mit Katabolit-Repressionsmedium (SOC) zugeben und 1 h bei 37 °C inkubieren.
- Bei 7000 × g 2 min eindrehen und den größten Teil des Überstands entfernen. Resuspendieren und auf einer Agarplatte aus Luria-Bouillon (LB) mit dem entsprechenden Auswahlantibiotikum anrichten.
Anmerkung: In dieser Studie wurde Carbenicillin verwendet.
- Über Nacht bei 37 °C inkubieren. Die Bienenvölker werden isoliert, indem man eine Pipettenspitze leicht auf eine der Kolonien drückt und sie in 3 ml LB-Medium mit 100 μg/ml Carbenicillin legt. 12-24 h bei 37 °C inkubieren.
- Extrahieren Sie die DNA der Plasmide mit dem Plasmid-DNA-Isolationskit gemäß den Anweisungen des Herstellers und bestätigen Sie die Sequenzen durch DNA-Sequenzierung.
- Für Ypet/3' UTR:
- Erstellen Sie ein lineares PCR-Template für die In-vitro-Transkription. Verwenden Sie einen vorderen Primer vor der Ypet-Sequenz und einen umgekehrten Primer mit 20 zusätzlichen Thyminrückständen. In Tabelle 2 finden Sie die Sequenz von Ypet/IL-7 3' UTR und die Sequenzen der Vorwärts- und Rückwärtsprimer.
Anmerkung: Diese zusätzlichen Thyminreste fügen der linearen mRNA nach der in vitro Transkription Oligo(A) hinzu.
- In-vitro-Transkribieren Sie das PCR-Produkt mit einem T7-Transkriptionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Reinigen Sie die resultierende komplementäre RNA (cRNA) mit einem Transkriptions-Clean-up-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Eluieren Sie die gereinigte cRNA in RNAse-freiem Wasser, messen Sie die Konzentration und bewerten Sie die Integrität durch Agaroseelektrophorese. Bei -80 °C lagern.
- Für mCherry:
- Erzeugen Sie ein lineares PCR-Template für die In-vitro-Transkription unter Verwendung eines High-Fidelity-Restriktionsenzyms; verwenden Sie das Restriktionsenzym mfEI-HF, wenn Sie dieses Beispiel replizieren. Über Nacht in einem Aufschlusspuffer bei 37 °C verdauen.
- Führen Sie ein Gel ein, um die Probe zu reinigen, und extrahieren Sie die lineare DNA mit einem Gel-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- In-vitro-Transkribieren Sie das PCR-Produkt mit einem T7-Transkriptionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Polyadenylieren Sie die cRNA (150-200 Nukleotide) mit einem Poly(A)-Tailing-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Reinigen Sie die resultierende cRNA mit einem Transkriptions-Clean-up-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Eluieren Sie die gereinigte cRNA in RNAse-freiem Wasser, messen Sie die mRNA-Konzentrationen und bewerten Sie die Integrität der Botschaft durch Gelelektrophorese. Bei -80 °C lagern.
3. Experimentelles Vorgehen
HINWEIS: Eine schematische Übersicht über die Mikroinjektion von Eizellen und die anschließende Zeitraffermikroskopie finden Sie in Abbildung 1.
- Tag 1
- Injizieren Sie 21 Tage alten Mäusen intraperitoneal 5 I.E. Serumgonadotropin der trächtigen Stute, um das Follikelwachstum bis zum Antralstadium zu fördern.
- Tag 3
- Entnahme von Eizellen
- Öffnen Sie vorsichtig die Antralfollikel, indem Sie mit einer 26 G Nadel einen kleinen Schnitt in die Follikelwand machen. Isolieren Sie intakte kumulusumschlossene Eizellen (KOK) mit mehreren Schichten von Kumuluszellen mit einer mundbetriebenen Glaspipette.
- Verwenden Sie eine kleinere Pipette (etwas größer als der Durchmesser der Eizelle) und entleeren Sie die KOK mechanisch durch wiederholtes Pipettieren.
Anmerkung: Alternativ können Sie eine Mikroinjektion an intakten KOKs durchführen.
- Aspirieren Sie die entblößten Eizellen mit einer größeren Pipette und legen Sie sie in eine Petrischale mit einem Reifungsmedium, das mit 1 μM des Phosphodiesterasehemmers Cilostamid versetzt ist, um die Wiederaufnahme der meiotischen Reifung zu verhindern. Stellen Sie die Schale für 2 Stunden in den Inkubator, damit sich die Eizellen von dem Stress erholen können, der durch die Isolierung der Eizellen von den Follikeln verursacht wird.
- Mikroinjektion von Eizellen
- Bereiten Sie die Injektionsnadeln vor, indem Sie ein 10 cm langes Kapillarrohr aus Borosilikatglas in einen mechanischen Abzieher einsetzen. Für eine optimale Injektion biegen Sie die Nadelspitze mit einem erhitzten Filament in einem 45°-Winkel.
- Bereiten Sie Styroporschalen mit 20 μl Tröpfchen basischem Eizellentnahmemedium zu und bedecken Sie die Tröpfchen mit leichtem Mineralöl.
- Bereiten Sie eine Reportermischung vor, indem Sie 12,5 μg/μl Ypet-3' UTR und 12,5 μg/μl mCherry hinzufügen. Bereiten Sie ein größeres Volumen vor und erstellen Sie Aliquote für zukünftige Experimente, um ähnliche Reporterkonzentrationen zu gewährleisten. Lagern Sie diese Aliquots bei -80 °C. Nach dem Auftauen wird das Aliquot zunächst 2 min lang bei 20.000 x g zentrifugiert und in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen umgefüllt.
Anmerkung: Diese Zentrifugation verhindert, dass die Injektionsnadel durch mögliche Aggregate in der Reportermischung verstopft wird.
- Beladen Sie die Injektionsnadel nach Kapillarität mit ca. 0,5 μl Reportermischung.
- Legen Sie die Haltepipette und die geladene Injektionsnadel in die Halterungen und positionieren Sie sie im Tröpfchen des Eizellentnahmemediums. Saugen Sie etwas von dem Medium in die Haltepipette ab.
- Öffnen Sie die Injektionsnadel, indem Sie vorsichtig gegen die Haltepipette klopfen.
- Legen Sie die Eizellen in ein Tröpfchen basisches Entnahmemedium und injizieren Sie 5-10 pL der Reportermischung.
- Inkubieren Sie die Eizellen im Reifungsmedium mit 1 μM Cilostamid für 16 Stunden, damit das mCherry-Signal ein Plateau erreicht.
- Bereiten Sie eine Petrischale vor, die für die Zeitraffermikroskopie verwendet wird, mit mindestens zwei 20-μl-Tröpfchen Reifungsmedium für jeden injizierten Reporter: ein Tröpfchen mit 1 μM Cilostamid für die Kontrolle der Prophase I-fixierten Eizellen und ein Tröpfchen ohne Cilostamid für die Reifung der Eizellen. Bedecken Sie die Tröpfchen mit leichtem Mineralöl und legen Sie sie in den Inkubator.
- Zeitraffer-Mikroskopie
- Nach der Vorinkubation nehmen Sie die injizierten Eizellen aus dem Inkubator und waschen Sie sie viermal in Reifemedium ohne Cilostamid. Bewahren Sie einige Eizellen in einem Reifungsmedium mit 1 μM Cilostamid als Prophase-I-arrestierte Eizell-Kontrollgruppe auf.
- Übertragen Sie die injizierten Eizellen in ihre jeweiligen Tröpfchen auf der zuvor vorbereiteten Zeitraffer-Mikroskopschale. Gruppieren Sie die Eizellen mit einer geschlossenen Glaspipette (eine geschlossene Pipette kann hergestellt werden, indem Sie die Spitze einige Sekunden lang in eine Flamme halten).
Anmerkung: Das Clustering der Eizellen hilft, ihre Bewegung während der Aufzeichnung zu verhindern.
- Stellen Sie die Schüssel unter das Mikroskop, das mit einem Leuchtdiodenbeleuchtungssystem und einem motorisierten Tisch ausgestattet ist, der mit einer Klimakammer ausgestattet ist, die bei 37 °C und 5 % CO2 gehalten wird. Um diese Studie zu replizieren, verwenden Sie die folgenden Parameter: Filtersatz: dichroitischer Spiegel YFP/CFP/mCherry 69008BS; YFP-Kanal (Anregung (Ex): S500/20 × 49057; Emission (EM): D535/30 m 47281), mCherry-Kanal (Bsp.: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m).
- Geben Sie die entsprechenden Einstellungen für das Zeitraffer-Experiment ein (siehe Materialtabelle für die in dieser Studie verwendete Software): Klicken Sie auf Apps | Mehrdimensionale Erfassung. Wählen Sie die erste Registerkarte Main und wählen Sie Zeitraffer, mehrere Tischpositionen und mehrere Wellenlängen aus.
- Wählen Sie den Reiter Speichern, um den Speicherort einzugeben, an dem das Experiment gespeichert werden soll.
- Wählen Sie den Reiter Zeitraffer, um die Anzahl der Zeitpunkte, die Dauer und das Zeitintervall einzugeben.
Anmerkung: Die Dauer des Zeitraffer-Experiments hängt von der untersuchten Tierart ab, da der Zeitpunkt der meiotischen Reifung der Eizellen von Tierart zu Art unterschiedlich ist. In diesem Experiment mit Maus-Eizellen wurden die Eizellen 16 Stunden lang alle 15 Minuten aufgezeichnet.
- Wählen Sie den Reiter Bühne. Schalten Sie das Hellfeld ein und lokalisieren Sie die Position der Eizellen, indem Sie ein neues Fenster öffnen, indem Sie Erfassen | Erwerben | Live zeigen. Sobald die Eizellen lokalisiert sind, wechseln Sie zurück zum Fenster "Mehrdimensionale Erfassung" und drücken Sie +, um die Position der Eizellen festzulegen.
- Wählen Sie den Reiter Wellenlängen und stellen Sie 3 verschiedene Wellenlängen für Hellfeld (Belichtung 15 ms), YFP (Belichtung 150 ms für Ypet/IL7 3' UTR) und mCherry (Belichtung 75 ms für Ypet/IL7 3' UTR) ein.
Anmerkung: Passen Sie die Belichtung für jeden Ypet/3'-UTR-Reporter basierend auf dem Grad der Reporterakkumulation und dem injizierten Volumen an. Stellen Sie sicher, dass das YFP-Signal zu Beginn des Experiments in der Mitte des Nachweisbereichs liegt, um eine Unterschätzung oder Sättigung im Falle einer Aktivierung der Translation zu vermeiden. Passen Sie für mCherry die Belichtung für jede Charge von mCherry an, da das Signal von der Anzahl der Adeninnukleotide abhängt, die während des Polyadenylierungsverfahrens hinzugefügt wurden. Aufgrund der unterschiedlichen Polyadenylierungseffizienz verwenden Sie die gleiche Charge mCherry in verschiedenen Experimenten, um einen besseren Vergleich zwischen den Experimenten zu ermöglichen.
- Starten Sie das Zeitraffer-Experiment, indem Sie auf Acquire klicken. In Abbildung 1 sehen Sie ein Beispiel für eine Zeitrafferaufnahme in einer einzelnen Eizelle.
- Analyse der UTR-Translation von Ypet-3
- Für diese Analyse (siehe Materialtabelle für die in dieser Studie verwendete Software) führen Sie für jede Eizelle zwei Regionsmessungen durch: die Eizelle selbst - klicken Sie auf die Ellipsenregion und umgeben Sie die Eizelle - und eine kleine Region in der Nähe der Eizelle, die für die Hintergrundsubtraktion verwendet werden soll - klicken Sie auf die rechteckige Region.
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass sich die Eizellen während der Zeitrafferaufnahme nicht aus der ausgewählten Region bewegen. Achten Sie besonders auf die Platzierung der Regionsmessung um die Polkörperextrusion, da dies zu Bewegungen in der Eizelle führt und die Aufzeichnung verfälschen kann.
- Exportieren Sie die Messdaten der Region in eine Tabelle, indem Sie zuerst auf Protokoll öffnen und dann auf Protokolldaten klicken, um die Datenanalysesoftware zu exportieren.
- Subtrahieren Sie für jede einzelne Eizelle und für alle gemessenen Zeitpunkte die Messung der Hintergrundregion von der Messung der Eizellregion. Führen Sie dies für YFP- und mCherry-Wellenlängen separat durch.
Tabelle 1: Vorbereitung der Medien. Liste der Komponenten, die hinzugefügt werden müssen, um das grundlegende Eizellentnahmemedium und das Eizellreifungsmedium herzustellen.
| Grundlegendes Medium zur Eizellentnahme | |
| Bestandteil | Für 500 mL |
| HEPES modifiziert Minimum Essential Medium Eagle | 7,1 g |
| Natriumbicarbonat | 252 mg |
| Natriumpyruvat | 1,15 mL |
| Penicillin/Streptomycin 100x | 5 mL |
| Reinstes destilliertes Wasser (Invitrogen, 10977-015) | Bis zu 500 mL |
| Reifemedium | |
| Bestandteil | Für 500 mL |
| MEM alpha 1x | Bis zu 500 mL |
| Natriumpyruvat | 1,15 mL |
| Penicillin/Streptomycin 100x | 5 mL |
Tabelle 2: Beispiel für Reporter- und Primersequenzen Sequenz des YFP/IL7 3'UTR-Reporters und Sequenzen von Vorwärts- und Rückwärtsprimern, die zur Herstellung eines linearen PCR-Templates für die In-vitro-Transkription verwendet wurden.
| Reihenfolge |
| Ypet/Interleukin-7 3' UTR | GAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAAGGCGAAGAGCTGTTCACC
GGCGTGGTGCCCATCCTGGTGGAGCTGGACGGCGACGTGAACGGCCACAAGTTCAGCGTGAGCGGCGAGGGCGAGGGCGAGGGCGACGCCCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGCTGCTGTGCACCACCCAAGCTG
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GTCAGTCCTTTGTCCTGAGGAACTGGTAAAATGGGTAAGCCCTTAGCTAGCGAACTGAAGGCATTCGCATGTAAGATAATCTCTATACCTGCAAGGCTCTGGATGGCTCCCCCTACCAATATTGAACAATATTCTGATT
TTGGCAAAATAAAGGATAATATTTT |
| Grundierung nach vorne | GAGAACCCACTGCTTAC |
| Umgekehrte Grundierung | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAATATCCTTTATTTTGCCAAAATC |
