HINWEIS: Als WEA-Steuerung wurde die Standard-Laborlinie Oregon R verwendet. Alle Fliegen wurden auf Standard-Maismehl-Melasse-Medium (mit Melasse, Agar, Hefe, Maismehl, Tegosept, Propionsäure und Wasser) bei Raumtemperatur mit 12/12 h Hell-Dunkel-Zirkadianz-Rhythmus aufgezogen.
1. Vorbereitung auf den Assay
- Weibliche Fliegen (0-2 Tage alt, nicht jungfräulich) unter CO2 -Anästhesie sammeln und mindestens 3 Tage vor den Experimenten auf Standard-Maismehlfutter erholen lassen.
- Hungern Sie die Fliegen für ~24 h bei Raumtemperatur (~23 °C) in Fläschchen mit einem Labortuch, das mit ~2 mL deionisiertem Wasser getränkt ist.
- Bereiten Sie das Fliegenfutter mit Bromphenolblau (BPB) wie folgt zu:
- Das Fliegenfutter in der Mikrowelle schmelzen und anschließend lauwarm abkühlen lassen.
- 1 ml 4% BPB zu 1 ml lauwarmem Futter geben und gut vermischen.
- Geben Sie mit einer Pipette das BPB-haltige Fliegenfutter in einen einzelnen Punkt (~200 μl) in der Mitte einer Petrischale.
2. Assay zur Überwachung der Darmsauerung
- Verhungerte Fliegen werden in eine Petrischale gegeben, die einzelne Punkte (200 μl) Fliegenfutter enthält, das mit 2 % Bromphenolblau (BPB) angereichert ist. Lassen Sie die Fliegen 4 Stunden bei Raumtemperatur unter Lichteinwirkung nach Nahrung suchen.
- Nach 4 Stunden die Fliegen einsammeln und auf Eis betäuben; ihre Eingeweide chirurgisch isolieren.
- Führen Sie die Operation in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einer Pinzette unter einem Stereomikroskop durch (siehe Materialtabelle). Isolieren Sie den Darm, indem Sie den Thorax mit einer Pinzette festhalten und den Bauch mit einem zweiten Paar nach unten ziehen, bis der CCR des Darms sichtbar ist, wobei Sie darauf achten, dass der Darm an beiden Enden befestigt bleibt.
- Bestimmen Sie die Übersäuerung des Darms, indem Sie die Farbe des CCR des Darms untersuchen (Abbildung 1C; gelb bedeutet angesäuert und blau bedeutet nicht angesäuert).
- Zählen Sie nur die Fliegen, die eine robuste BPB-Färbung im Darm aufweisen.
- Berechnen Sie den Prozentsatz mit der folgenden Gleichung:
Prozentualer Anteil der Fliegen mit angesäuerten Eingeweiden = Anzahl der angesäuerten Fliegen × 100 / (Anzahl der angesäuerten Fliegen + Anzahl der nicht angesäuerten Fliegen)
Anmerkung: Ein Prozentsatz von 0 bedeutet, dass keine Fliegen ihren Darm übersäuert haben, während ein Prozentsatz von 100 bedeutet, dass alle Fliegen ihren Darm angesäuert haben.
