Mitochondrial Calcium Uptake Assay: Eine auf Plattenlesern basierende Methode zur Messung der Kalziumaufnahme in isolierten Mitochondrien

1. Reagenzien und Lösungen

1. Stellen Sie 500 mL MS-EGTA-Puffer für die mitochondriale Isolierung her: 225 mM Mannitol, 75 mM Saccharose, 5 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES), 1 mM Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure (EGTA), pH-Wert eingestellt auf 7,4 mit KOH. Sterilisieren Sie ihn durch einen 0,22-μm-Filter und lagern Sie ihn bei 4 °C. Stellen Sie sicher, dass der MS-EGTA-Puffer vor der Verwendung auf 4 °C vorgekühlt ist.
2. Bereiten Sie 100 mL KCl-Puffer vor: 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM KH₂PO₄, 2 mM MgCl₂, 40 μM EGTA und pH-Wert eingestellt auf 7,2 mit KOH. Lagern Sie es bei Raumtemperatur.
3. Bereiten Sie 1 mM Calciumgrün-5N-Brühe in Dimethylsulfoxid (DMSO) vor. Der Calciumgrün-5N-Stamm kann aliquotiert und bei -20 °C gelagert werden.
4. Bereiten Sie die Substrate für die Aufnahme von Ca²⁺ vor.
   1. Bereiten Sie 1 M Natriumpyruvat mit einem pH-Wert von 7,4 vor. In Aliquoten bei -20 °C lagern.
   2. Bereiten Sie 500 mM Malat mit einem pH-Wert von 7,4 vor. In Aliquoten bei -20 °C lagern.

2. Isolierung der kardialen Mitochondrien

1. Euthanasieren Sie die Maus nach institutionellen Standards.
   Anmerkung: Für unsere institutionell anerkannte Methode der Euthanasie wurden Mäuse durch Isofluoran-Inhalation betäubt und durch Zervixluxation getötet.
2. Entnehmen Sie das Herz, indem Sie die Brusthöhle öffnen, entlang beider Seiten der Rippen schneiden, das Herz flankieren, das Zwerchfell wegschneiden und das Herzgewebe herausschneiden.
   Anmerkung: In diesem Protokoll wird die mitochondriale Isolierung aus einem ganzen Herz durchgeführt, das von einer erwachsenen Maus entnommen wurde (ca. 120 mg), was für 3-4 Experimente ausreichen sollte. Für die mitochondriale Isolierung aus anderen mitochondrienreichen Geweben wie der Leber können bis zu 200 mg Gewebe gemäß dem beschriebenen Protokoll verwendet werden.
3. Spülen Sie das Gewebe gründlich mit 25 ml eiskalter 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und achten Sie darauf, dass das gesamte Blut aus den Ventrikeln herausgedrückt wird.
   Anmerkung: Das Herz wird ausreichend gespült, wenn die aus dem Herzen gepresste Flüssigkeit klar ist.
4. Das Herz in 5 mL eiskaltem 1x PBS mit einer scharfen Schere in kleine Stücke hacken.
5. Entsorgen Sie das PBS und geben Sie das zerkleinerte Herzgewebe in einen vorgekühlten 7-ml-Glas-Teflon-Dounce-Homogenisator mit einem Abstand von 0,10 bis 0,15 mm.
6. Geben Sie 5 ml eiskalten MS-EGTA-Puffer hinzu und homogenisieren Sie die Probe, bis die Gewebestücke nicht mehr sichtbar sind (ca. 11 Schläge).
   Anmerkung: Homogenisieren Sie das Gewebe nicht zu sehr, da das Ziel darin besteht, intakte und funktionsfähige Mitochondrien zu erhalten.
7. Übertragen Sie das Homogenat in ein 15-ml-Röhrchen.
8. Das Homogenat wird bei 600 x g bei 4 °C für 5 min zentrifugiert, um Zellkerne und unbeschädigte Zellen zu pelletieren.
9. Übertragen Sie den Überstand in ein frisches 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie ihn bei 10.000 x g bei 4 °C für 10 Minuten, um die Mitochondrien zu pelletieren.
10. Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie das mitochondriale Pellet auf Eis auf.
11. Waschen Sie das mitochondriale Pellet zweimal mit eiskaltem MS-EGTA-Puffer. Bei jeder Wäsche wird das mitochondriale Pellet in 5 ml MS-EGTA-Puffer resuspendiert, bei 10.000 x g bei 4 °C für 10 min zentrifugiert und der Überstand verworfen.
12. Nach der letzten Wäsche den Überstand entsorgen und die Mitochondrien in 100 μl eiskaltem MS-EGTA-Puffer resuspendieren. Halten Sie die Mitochondrien auf Eis.
    Anmerkung: Mitochondrien sollten innerhalb von 1 h für Experimente verwendet werden.
13. Messen Sie die mitochondriale Proteinkonzentration mit einem Bradford-Protein-Assay.

3. Plattenleser-basierte Messung der mitochondrialen Kalziumaufnahme

HINWEIS: Hier wird das Protokoll zur Analyse der mitochondrialen Ca2⁺-Aufnahme mit einem Multimode-Plattenleser beschrieben, der mit Injektoren ausgestattet ist. Es kann jeder Platten-Reader verwendet werden, der in der Lage ist, die Calciumgrün-5N-Fluoreszenz (Anregung/Emission von 506/532 nm) in einem kinetischen Modus mit automatisierten Reagenzieninjektoren zu lesen, um die Reaktion vor Licht zu schützen.

1. Programmieren Sie den Platten-Reader so, dass er eine kinetische Messung der Calciumgrün-5N-Fluoreszenz durchführt, wobei die Messungen jede Sekunde für eine Gesamtassay-Zeit von 1.000 s durchgeführt werden. Programmieren Sie zusätzlich die Reagenzinjektoren so, dass sie 5 μl CaCl_2-Lösung zu den Zeitpunkten 30 s, 150 s, 300 s, 480 s und 690 s abgeben.
   Anmerkung: Der Zeitpunkt der CaCl_{2-Injektionen} ist benutzerdefiniert und kann je nach experimentellem Bedarf angepasst werden.
2. Die Reagenzinjektoren werden mit der zu verwendenden CaCl_2-Lösung grundiert.
   Anmerkung: Die Konzentration der CaCl_2-Lösung ist benutzerdefiniert und kann in nachfolgenden Durchläufen angepasst werden, um die Menge an Ca2⁺ zu titrieren, die zum Auslösen der MPTP-Öffnung erforderlich ist.
3. Geben Sie 200 μg Mitochondrien in eine einzelne Vertiefung einer 96-Well-Platte.
4. Geben Sie das entsprechende Volumen an KCl-Puffer in die Vertiefung, so dass das Gesamtvolumen der Mitochondrien und des KCl-Puffers 197 μl beträgt.
5. 1 μl 1 M Pyruvat und 1 μl 500 mM Malat zur Mitochondrienmischung geben. Pipettieren Sie vorsichtig, um sie zu mischen, und inkubieren Sie die Mitochondrien mit den Substraten 2 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit die Mitochondrien mit Energie versorgt werden können.
6. 1 μl 1 mM Calciumgrün-5N-Stamm zugeben. Vorsichtig durch Pipettieren mischen.
   Anmerkung: Schützen Sie die Reaktion vor Licht nach Zugabe des Farbstoffs Calciumgrün-5N.
7. Starten Sie das vorprogrammierte kinetische Protokoll und überwachen Sie die Calciumgrün-5N-Fluoreszenz.