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1. Reagenzien und Lösungen
- Stellen Sie 500 mL MS-EGTA-Puffer für die mitochondriale Isolierung her: 225 mM Mannitol, 75 mM Saccharose, 5 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES), 1 mM Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure (EGTA), pH-Wert eingestellt auf 7,4 mit KOH. Sterilisieren Sie ihn durch einen 0,22-μm-Filter und lagern Sie ihn bei 4 °C. Stellen Sie sicher, dass der MS-EGTA-Puffer vor der Verwendung auf 4 °C vorgekühlt ist.
- Bereiten Sie 100 mL KCl-Puffer vor: 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2, 40 μM EGTA und pH-Wert eingestellt auf 7,2 mit KOH. Lagern Sie es bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie 1 mM Calciumgrün-5N-Brühe in Dimethylsulfoxid (DMSO) vor. Der Calciumgrün-5N-Stamm kann aliquotiert und bei -20 °C gelagert werden.
- Bereiten Sie die Substrate für die Aufnahme von Ca2+ vor.
- Bereiten Sie 1 M Natriumpyruvat mit einem pH-Wert von 7,4 vor. In Aliquoten bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie 500 mM Malat mit einem pH-Wert von 7,4 vor. In Aliquoten bei -20 °C lagern.
2. Isolierung der kardialen Mitochondrien
- Euthanasieren Sie die Maus nach institutionellen Standards.
Anmerkung: Für unsere institutionell anerkannte Methode der Euthanasie wurden Mäuse durch Isofluoran-Inhalation betäubt und durch Zervixluxation getötet.
- Entnehmen Sie das Herz, indem Sie die Brusthöhle öffnen, entlang beider Seiten der Rippen schneiden, das Herz flankieren, das Zwerchfell wegschneiden und das Herzgewebe herausschneiden.
Anmerkung: In diesem Protokoll wird die mitochondriale Isolierung aus einem ganzen Herz durchgeführt, das von einer erwachsenen Maus entnommen wurde (ca. 120 mg), was für 3-4 Experimente ausreichen sollte. Für die mitochondriale Isolierung aus anderen mitochondrienreichen Geweben wie der Leber können bis zu 200 mg Gewebe gemäß dem beschriebenen Protokoll verwendet werden.
- Spülen Sie das Gewebe gründlich mit 25 ml eiskalter 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und achten Sie darauf, dass das gesamte Blut aus den Ventrikeln herausgedrückt wird.
Anmerkung: Das Herz wird ausreichend gespült, wenn die aus dem Herzen gepresste Flüssigkeit klar ist.
- Das Herz in 5 mL eiskaltem 1x PBS mit einer scharfen Schere in kleine Stücke hacken.
- Entsorgen Sie das PBS und geben Sie das zerkleinerte Herzgewebe in einen vorgekühlten 7-ml-Glas-Teflon-Dounce-Homogenisator mit einem Abstand von 0,10 bis 0,15 mm.
- Geben Sie 5 ml eiskalten MS-EGTA-Puffer hinzu und homogenisieren Sie die Probe, bis die Gewebestücke nicht mehr sichtbar sind (ca. 11 Schläge).
Anmerkung: Homogenisieren Sie das Gewebe nicht zu sehr, da das Ziel darin besteht, intakte und funktionsfähige Mitochondrien zu erhalten.
- Übertragen Sie das Homogenat in ein 15-ml-Röhrchen.
- Das Homogenat wird bei 600 x g bei 4 °C für 5 min zentrifugiert, um Zellkerne und unbeschädigte Zellen zu pelletieren.
- Übertragen Sie den Überstand in ein frisches 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie ihn bei 10.000 x g bei 4 °C für 10 Minuten, um die Mitochondrien zu pelletieren.
- Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie das mitochondriale Pellet auf Eis auf.
- Waschen Sie das mitochondriale Pellet zweimal mit eiskaltem MS-EGTA-Puffer. Bei jeder Wäsche wird das mitochondriale Pellet in 5 ml MS-EGTA-Puffer resuspendiert, bei 10.000 x g bei 4 °C für 10 min zentrifugiert und der Überstand verworfen.
- Nach der letzten Wäsche den Überstand entsorgen und die Mitochondrien in 100 μl eiskaltem MS-EGTA-Puffer resuspendieren. Halten Sie die Mitochondrien auf Eis.
Anmerkung: Mitochondrien sollten innerhalb von 1 h für Experimente verwendet werden.
- Messen Sie die mitochondriale Proteinkonzentration mit einem Bradford-Protein-Assay.
3. Plattenleser-basierte Messung der mitochondrialen Kalziumaufnahme
HINWEIS: Hier wird das Protokoll zur Analyse der mitochondrialen Ca2+-Aufnahme mit einem Multimode-Plattenleser beschrieben, der mit Injektoren ausgestattet ist. Es kann jeder Platten-Reader verwendet werden, der in der Lage ist, die Calciumgrün-5N-Fluoreszenz (Anregung/Emission von 506/532 nm) in einem kinetischen Modus mit automatisierten Reagenzieninjektoren zu lesen, um die Reaktion vor Licht zu schützen.
- Programmieren Sie den Platten-Reader so, dass er eine kinetische Messung der Calciumgrün-5N-Fluoreszenz durchführt, wobei die Messungen jede Sekunde für eine Gesamtassay-Zeit von 1.000 s durchgeführt werden. Programmieren Sie zusätzlich die Reagenzinjektoren so, dass sie 5 μl CaCl2-Lösung zu den Zeitpunkten 30 s, 150 s, 300 s, 480 s und 690 s abgeben.
Anmerkung: Der Zeitpunkt der CaCl2-Injektionen ist benutzerdefiniert und kann je nach experimentellem Bedarf angepasst werden.
- Die Reagenzinjektoren werden mit der zu verwendenden CaCl2-Lösung grundiert.
Anmerkung: Die Konzentration der CaCl2-Lösung ist benutzerdefiniert und kann in nachfolgenden Durchläufen angepasst werden, um die Menge an Ca2+ zu titrieren, die zum Auslösen der MPTP-Öffnung erforderlich ist.
- Geben Sie 200 μg Mitochondrien in eine einzelne Vertiefung einer 96-Well-Platte.
- Geben Sie das entsprechende Volumen an KCl-Puffer in die Vertiefung, so dass das Gesamtvolumen der Mitochondrien und des KCl-Puffers 197 μl beträgt.
- 1 μl 1 M Pyruvat und 1 μl 500 mM Malat zur Mitochondrienmischung geben. Pipettieren Sie vorsichtig, um sie zu mischen, und inkubieren Sie die Mitochondrien mit den Substraten 2 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit die Mitochondrien mit Energie versorgt werden können.
- 1 μl 1 mM Calciumgrün-5N-Stamm zugeben. Vorsichtig durch Pipettieren mischen.
Anmerkung: Schützen Sie die Reaktion vor Licht nach Zugabe des Farbstoffs Calciumgrün-5N.
- Starten Sie das vorprogrammierte kinetische Protokoll und überwachen Sie die Calciumgrün-5N-Fluoreszenz.