1. Vorbereitung von großen unilamellären Vesikeln (LUVs)
- Bereiten Sie LUVs für ihre Verwendung als Zellmembran-Imitatoren für Fluoreszenz-Leckage-Assays vor.
- Mischen Sie mit einer Hamilton-Glasspritze Phosphatidylcholin (DOPC, 786,11 g/mol), Sphingomyelin (SM, 760,22 g/mol) und Cholesterin (Chol, 386,65 g/mol) im molaren Verhältnis 4:4:2. Die Lipidlösung wird aus einer Stammlösung jedes Lipids gewonnen, das in einem Methanol/Chloroform-Lösungsmittel (3/1; Volumen/Volumen) bei 25 mg/ml in einem 25-ml-Glaskolben mit rundem Boden solubilisiert ist. Basierend auf 4 μmol DOPC, 4 μmol SM und 2 μmol Chol wird die Lipidlösung aus Stammlösung durch Mischen von 126 μl, 117 μl bzw. 31 μl erhalten.
Vorsicht: Methanol ist ein giftiges und brennbares Lösungsmittel und Chloroform ist giftig und krebserregend. Beide sollten mit dem entsprechenden Schutz unter einer Haube gehandhabt werden.
- Methanol/Chloroform mit einem Rotationsverdampfer unter Vakuum während 45-60 min bei 60 °C verdampfen, bis sich ein getrockneter Lipidfilm bildet.
- Bereiten Sie zwei HEPES-Pufferlösungen vor. Bereiten Sie HEPES-Puffer 1 vor, indem Sie 20 mM HEPES (238,3 g/mol) und 75 mM NaCl (58,44 g/mol) mischen und den pH-Wert auf 7,4 einstellen. Bereiten Sie HEPES-Puffer 2 vor, indem Sie 20 mM HEPES und 145 mM NaCl mischen und den pH-Wert auf 7,4 einstellen. HEPES-Puffer können 1 Monat lang bei 4 °C gelagert werden.
Anmerkung: Es wird empfohlen, die Osmolarität der Puffer mit einem Osmometer zu überprüfen.
- Bereiten Sie eine Lipidhydratationslösung vor, indem Sie das membranundurchlässige Fluoreszenzfarbstoffquencherpaar, 8-Aminonaphthalin-1, 3, 6-Trisulfonsäure, Dinatriumsalz bei 12,5 mM (ANTS, 427,33 g/mol) und p-Xylol-Bispyridiniumbromid bei 45 mM (DPX, 422,16 g/mol) in HEPES-Pufferlösung auflösen. Das Mischen von ANTS mit DPX führt zu einer gelb gefärbten Lösung. Um die Konzentrationen von 12,5 mM ANTS und 45 mM DPX zu erreichen, lösen Sie 21,4 mg bzw. 76 mg in 4 mL HEPES-Puffer 1,
Anmerkung: Die Lipidhydratationslösung kann 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden, indem die Tube mit Alufolie umwickelt wird.
- Rekonstituieren Sie multilamelläre Vesikel (MLV), indem Sie den getrockneten Lipidfilm mit 1 ml der Lipidhydratationslösung resuspendieren und bis zur Auflösung des getrockneten Lipidfilms vortexen. Stellen Sie sicher, dass die Lösung vollständig löslich ist, da sich kleine Lipidaggregate negativ auf die vorangegangenen Schritte auswirken. Kontrollieren Sie auch die Wand des Glaskolbens mit rundem Boden, um sicherzustellen, dass kein Lipidfilm vorhanden ist.
Anmerkung: Die Lösung erscheint nach der Solubilisierung opaleszierend und hellgelb.
- Die Vesikel werden fünf Gefrier-/Auftauzyklen unterzogen, um unilamelläre Vesikel zu erhalten. Bei jedem Zyklus wird der Glaskolben mit rundem Boden 30 s lang in flüssigen Stickstoff eingelegt, um ihn einzufrieren, und dann für den Auftauschritt 2 Minuten lang in einem Wasserbad belassen.
Anmerkung: Die Temperatur des Badewassers sollte 5-10°C höher sein als die Schmelztemperatur der Lipide.
- Bereiten Sie den Lipid-Extruder vor, indem Sie zwei mit HEPES-Puffer befeuchtete Filterstützen in jedes Polytetrafluorethylen (PTFE)-Extruderstück einsetzen, das in den Metallextruderbehälter gelegt wird.
- Legen Sie eine befeuchtete HEPES-Polycarbonatmembran (0,1 μm Porengröße, 25 mm Durchmesser) auf die Oberseite eines Filterträgers.
- Montieren Sie die beiden Metall-Extruder-Kanister und schrauben Sie sie fest.
- Setzen Sie den zusammengebauten Extruder in den Halter ein und führen Sie eine 1-ml-Spritze in das entsprechende Loch am Ende jedes Polytetrafluorethylen-Extruderstücks ein. Die Extrusion entspricht dem Durchgang der getesteten Flüssigkeit von einer Spritze zur anderen durch die Polycarbonatmembran.
- Testen Sie den Extruder mit 1 ml HEPES-Puffer, der in eine der 1-ml-Spritzen geladen ist, um sicherzustellen, dass keine Lecks oder Probleme vorhanden sind.
- Ersetzen Sie den 1 mL HEPES-Puffer durch die MLV-Probe.
- Führen Sie die Extrusion durch, indem Sie die MLV-Probe mindestens 21 Mal von einer Spritze zur anderen durch die Polycarbonatmembran leiten, um gleichmäßige LUVs gleicher Größe zu erhalten.
Anmerkung: Die Extrusion sollte bei einer Temperatur durchgeführt werden, die höher ist als die Schmelztemperatur des Lipidgemisches.
2. Reinigung von LUVs
- Bereiten Sie eine Säulenreinigung vor, um nicht verkapselte ANTS und DPX-Überschüsse zu entfernen.
- Vernetztes Dextran-Gel (G-50), das in wässrigem Medium mit 0,01 % NaN3 (65 g/mol) resuspendiert ist, wird in einer flüssigen Chromatographiesäule (Luer-Lock, nicht ummantelt, 1,0 cm x 20 cm, Bettvolumen 16 ml) bis zu 1 cm unterhalb der Oberseite des farblosen Teils der Säule eingeführt.
- Öffnen Sie den Wasserhahn und lassen Sie die Flüssigkeit fließen, um das vernetzte Dextrangel abzusetzen.
- Waschen Sie die Säule, indem Sie sie mit 20 mL HEPES-Puffer 2 eluieren, und verwerfen Sie den Ausgangsstrom der Säule.
- Schließen Sie den Hahn, sobald das Totvolumen des Lösungsmittels über der Säule minimiert ist (<100 μl), aber ausreichend, um ein Austrocknen des vernetzten Dextrangels zu vermeiden.
- Legen Sie die frisch extrudierten LUVs (gelb) auf die Säule und lassen Sie sie in das vernetzte Dextrangel einziehen.
- Geben Sie kontinuierlich HEPES-Puffer 2 in die Säule, um die LUV-Aufreinigung durchzuführen.
- Eluieren Sie ca. 2 ml HEPES-Puffer 2 (vergessen Sie nicht, den oberen Teil der Säule regelmäßig zu füllen, um ein Austrocknen des vernetzten Dextrangels zu vermeiden): Die freie gelbe ANTS- und DPX-Lösung wandert langsamer als die Liposomen.
- Beginnen Sie mit dem Sammeln von gereinigten LUVs in Röhrchen (1,5 ml).
- Beobachten Sie die Tropfen des Eluents aus der Säule und wenn sie opaleszierend werden, enthalten sie Liposomen. Wechseln Sie das Rohr, um die LUV-haltige Fraktion zurückzugewinnen.
- Eluieren, bis die Tropfen nicht mehr opaleszierend sind (~1 mL). Danach eluieren Sie weitere 0,5 mL in einer separaten Fraktion und stoppen Sie dann die Eluierung.
HINWEIS: Standards sind jetzt in einer Vielzahl von Molekulargewichten erhältlich, als Kits oder einzelne Molekulargewichte zur Kalibrierung des Elutionsvolumens der LUVs.
- Wickeln Sie die Röhrchen mit den LUVs in Alufolie ein, um ein Ausbleichen des Fluoreszenzfarbstoffs zu vermeiden.
- Waschen Sie die Säule mit 20 mL HEPES-Puffer 2.
- Die LUVs können dann eine Woche lang bei 4 °C gelagert werden.
HINWEIS: Da die LUV-Stabilität von der LUV-Konzentration und -Zusammensetzung sowie von der Ionenstärke abhängen kann, sollte die Größe der LUVs mit einem Instrument der dynamischen Lichtstreuung (DLS) kontrolliert werden (siehe Abschnitt 4. Charakterisierung der LUV-Größe und -Homogenität) vor jedem Versuch.
3. Quantifizierung der Konzentration von LUVs
- Schätzen Sie die LUV-Konzentration mit einem Phospholipid-Quantifizierungskit, das die Bewertung der Cholinkonzentration ermöglicht. Dieser Assay kann angewendet werden, wenn der Phospholipidgehalt mit cholinhaltigem Polkopf erheblich ist (>50% der LUVs).
- Bereiten Sie das Farbreagenz vor, indem Sie 18 mg Chromogensubstrat in 3 ml des mitgelieferten Puffers auflösen.
- Laden Sie eine Polystyrolküvette, 10 x 10 x 45 mm, mit 3 mL Farbreagenz.
- Verwenden Sie das reine Farbreagenz als Blindbedingung (Blank). Fügen Sie 20 μl LUV-Probe (Test) oder 20 μl Standardlösung mit bekannter Cholinkonzentration (Standard) hinzu.
- Gut mischen und 5 Minuten bei 37 °C unter allen Bedingungen (Blank, Test und Standard) inkubieren.
- Die Extinktion (optische Dichte, OD) des Prüflings und der Standardlösung wird mit der Blindlösung als Kontrolle bei 600 nm mit einem Spektralphotometer gemessen.
- Überprüfung der OD-Werte, die es ermöglichen, die Lipidkonzentration der LUVs, C[LUV], im Cholinäquivalent im Vergleich zum Standard der bekannten Konzentration abzuschätzen.
- Führen Sie die Berechnung mit der folgenden Gleichung durch:
C[LUV] (mol / l) = (OD Probe / OD Standard) x C[Standard] (mol / l)
HINWEIS: Das Phospholipid-Quantifizierungskit enthielt eine Cholinchlorid-Standardlösung (139,6 mg/l) mit 54 mg/dl, was der molaren Konzentration von C[Standard] = 3,87 mmol/l entspricht. OD-Probe und OD-Standard sind die bei 600 nm gemessenen Extinktionen für die LUV- bzw. Cholinlösungen.
4. Charakterisierung der LUV-Größe und -Homogenität
- Führen Sie eine Messung mit einem DLS-Gerät durch, um die LUV-Größe (in nm) und den Polydispersitätsindex (PdI) zu bestimmen.
- Programmieren Sie die entsprechende "Standard Operation Procedure" (SOP), indem Sie die Viskosität des Lösungsmittels/Puffers und der verwendeten Küvette angeben.
- 500 μl der LUV-Lösung in eine Halbmikroküvette aus Polystyrol geben.
- Setzen Sie die Halbmikroküvette aus Polystyrol in ein DLS-Instrument ein.
- Bei Raumtemperatur ist die Größenverteilung in Bezug auf die mittlere Größe (Z-Durchschnitt) der Partikelverteilung und die Homogenität (Polydispersitätsindex, PdI) zu messen.
- Alle Ergebnisse ergeben sich aus zwei unabhängigen Messungen, die jeweils in drei sich wiederholenden Zyklen durchgeführt werden.
HINWEIS: Die Standardwerte für LUVs betragen eine mittlere Größe von 137 ± 7 nm mit einem PdI von 0,149 ± 0,041.
5. Herstellung von Peptidlösungen
- Bereiten Sie eine Stammlösung des Peptids vor, die für den Leckage-Assay analysiert werden soll.
- Peptidpulver (>95% Reinheit) in reinem Wasser auflösen (z.B. 1 mg Peptid in 500 μl reinem Wasser).
Anmerkung: Es wird empfohlen, Peptide in reinem Wasser zu verdünnen und eine Dimethylsulfoxid (DMSO)-Solubilisierung zu vermeiden, die Artefakte (z. B. Membranpermeabilisierung) hervorrufen könnte.
- Die Peptidlösung 5 s lang vortexen.
- Die Peptidlösung wird 5 min lang in einem Wasserbeschallungsbad beschallt und anschließend 5 min lang bei 12.225 x g zentrifugiert. Sammeln Sie den Überstand für die Konzentrationsbestimmung.
- Messen Sie die Extinktion von drei unabhängigen Peptidverdünnungen bei 280 nm und berechnen Sie dann die Peptidkonzentration anhand des molaren Extinktionskoeffizienten ε (abhängig vom Tryptophan- und Tyrosingehalt in der Peptidsequenz) und der Beer-Lambert-Regel.
Anmerkung: Enthält das Peptid Tryptophan und Tyrosin, wird der molare Extinktionskoeffizient ε auf der Grundlage von Tryptophan ε = 5.690 M-1 cm-1 und Tyrosin ε = 1.280 M-1 cm-1 berechnet. Wenn die Peptidsequenz kein Tryptophan oder Tyrosin enthält, kann ein anderer kolorimetrischer Assay durchgeführt werden, um die Konzentration zu messen (z. B. BCA oder Bradford).
- Die Peptidlösung wird in reinem Wasser auf eine von 100 μM verdünnt und bei 4 °C gelagert
Anmerkung: In reinem Wasser findet während der Lagerung bei 4 °C kein Peptidabbau statt. Die Peptidkonzentration sollte jedoch alle 2 Wochen gemessen werden, um sicherzustellen, dass keine Wasserverdunstung stattfindet.
6. Fluoreszenz-Leckage-Assay
- Der Fluoreszenz-Leckage-Assay wird mit einem Spektrofluorometer bei Raumtemperatur gemessen. Die Anregungs- und Emissionswellenlänge sind auf Ex = 360 nm ± 3 nm bzw. Em = 530 nm ± 5 nm festgelegt.
- LUVs in 1 mL HEPES-Puffer 2 in einer Quarzfluoreszenzküvette auf eine Endkonzentration von 100 μM verdünnen. Fügen Sie einen Magnetrührer hinzu, um die Lösung während des Experiments zu homogenisieren.
- Messen Sie die LUVs allein während der ersten 100 s zwischen t = 0 s und t = 99 s, um auf die Hintergrundfluoreszenz zuzugreifen.
Anmerkung: Während des gesamten Experiments (15 min) konnten auch alleinige LUVs gemessen werden, um auf Hintergrundfluoreszenz und mögliche Lecks zuzugreifen.
- Danach ist die Leckage als Erhöhung der Fluoreszenzintensität nach Zugabe von Aliquoten der Peptidlösung für die nächsten 900 s (15 min) zu messen. Dieses Protokoll wird für jede getestete Peptidkonzentration von 0,1 μM bis 2,5 μM durchgeführt.
- Schließlich wurde eine Fluoreszenz von 100 % durch Solubilisierung der LUVs durch Zugabe von 1 μl Triton X-100 (0,1 %, v/v) erreicht, was zu einer vollständig ungelöschten Sonde zwischen t = 1.000 s und t = 1.100 s führte.
7. Quantifizierung der Leckage
- Unterdrücken Sie Werte, die nach t = 1.090 s erhalten wurden, um für jede getestete Bedingung die gleiche Punktzahl beizubehalten.
- Berechnen Sie die minimale Fluoreszenz Fmin, indem Sie den Durchschnitt von 50 Punkten zwischen t = 0 s und t = 49 s (nur LUVs) berechnen.
- Berechnen Sie die maximale Fluoreszenz, Fmax, indem Sie den Durchschnitt von 50 Punkten zwischen t = 1.041 s und t = 1.090 s (LUVs mit Triton X-100) ermitteln.
- Berechnen Sie den prozentualen Leck (%Leck) zu jedem Zeitpunkt (t = x) gemäß der folgenden Gleichung:
%Leck(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) x 100
- Berechnen Sie den Durchschnitt und die Standardabweichung für Werte, die mit einer unterschiedlichen LUV-Präparation (n ≥ 2) für denselben Zustand erhalten wurden.
- Plotten Sie den prozentualen Anteil der Leckage, %Leck(t=x)), in Abhängigkeit von der Zeit (s).
