Löslicher Proteinassay zur Quantifizierung des Gehalts an löslichen Proteinen in Pflanzengeweben

1. Sammeln und Verarbeiten von Pflanzen

1. Sammeln und Verarbeiten von Pflanzenproben
   1. Nach der Entnahme von Pflanzenproben die Proben schockfrosten, indem das Pflanzenmaterial mit einer Pinzette in flüssigen Stickstoff getaucht und bei -80 °C gelagert wird. Wenn die entnommenen Pflanzenproben zu groß sind, um sie schockfrosten zu können, kühlen Sie die Proben schnell mit Trockeneis ab und stellen Sie sie so schnell wie möglich in einen -80 °C-Gefrierschrank. Der Makronährstoffgehalt von Pflanzenmaterial kann sich ändern, nachdem das Gewebe von der Pflanze getrennt wurde, daher ist es wichtig, Pflanzenproben so schnell wie möglich nach der Entnahme einzufrieren.
      ACHTUNG: Flüssiger Stickstoff kann bei Kontakt mit der Haut schwere Erfrierungen verursachen. Bitte stellen Sie sicher, dass Sie flüssigen Stickstoff in zugelassenen Behältern transportieren und während der Handhabung geeignete PSA tragen, einschließlich Kryohandschuhen, Schutzbrille, Gesichtsschutz, Schürze und einem Laborkittel.
   2. Lyophilisieren Sie Pflanzenmaterial mit einem Gefriertrockner, um sicherzustellen, dass das Gewebe während der Wasserentnahme metabolisch inaktiv ist. Trocknen, bis sich die Masse der Probe stabilisiert hat, um sicherzustellen, dass das gesamte Wasser entfernt wurde.
   3. Sobald die Proben getrocknet sind, mit einer Mühle oder Mühle zu einem feinen Pulver mahlen. Lagern Sie die Proben bis zur Analyse in einem Trockenschrank.

2. Assay für lösliche Proteine

1. Probenvorbereitung
   1. Wiederholen Sie Proben jedes Gewebes, jeweils ca. 20 mg, in 1,5-ml-Polystyrol-Mikrozentrifugenröhrchen und Etikettenröhrchen ab. Diese Proben werden im Folgenden als unbekannte Proben bezeichnet. Notieren Sie die genaue Masse jeder Probe, da diese Informationen zur Berechnung des prozentualen löslichen Proteins in jeder unbekannten Probe erforderlich sind. Verwenden Sie Mikrozentrifugenröhrchen mit verschließbaren Deckeln, da sich nicht verriegelnde Deckel während des nachfolgenden Erhitzungsschritts öffnen können, was zum Verlust der Probenlösung führt.
2. Solubilisieren und Isolieren unbekannter Probenproteine
   1. Geben Sie mit einer Mikropipette 500 μl 0,1 M NaOH in jedes Röhrchen. Schließen Sie die Lider fest und beschallen Sie sie 30 Minuten lang. Ein heißes Wasserbad auf 90 °C vorheizen.
      ACHTUNG: Natriumhydroxid ist eine starke Base und kann bei Kontakt mit der Haut Verbrennungen verursachen. Obwohl 0,1 M NaOH eine geringe Konzentration darstellt, tragen Sie Schutzhandschuhe, um Hautreizungen zu vermeiden.
   2. Legen Sie die Schläuche für 15 Minuten in ein Gestell in das heiße Wasserbad.
   3. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 15.000 x g für 10 Minuten. Pipettieren Sie die überstehende Flüssigkeit in neue markierte Mikrozentrifugenröhrchen, wobei für jede Probe eine neue Pipettenspitze verwendet wird. Geben Sie 300 μl 0,1 M NaOH in das Röhrchen mit dem Pellet und zentrifugieren Sie erneut bei 15.000 x g für 10 Minuten. Auch hier wird die überstehende Flüssigkeit aufgefangen und mit der anderen überstehenden Flüssigkeit aus derselben Probe kombiniert. Dies ist ein potenzieller Haltepunkt, und die Proben können bei Bedarf über Nacht bei 4 °C gelagert werden.
3. Pflanzliche Proteine ausfällen
   1. Neutralisieren Sie den pH-Wert der überstehenden Lösung, indem Sie 11 μl 5,8 M HCl hinzufügen. Bestätigen Sie einen pH-Wert von ~7, indem Sie Lackmuspapier in jede Probenlösung tauchen.
      ACHTUNG: Salzsäure ist eine stark ätzende Säure, die bei Kontakt mit der Haut (Hautanwendung oder Inhalation) Verbrennungen verursachen kann. Bitte tragen Sie Handschuhe, um Hautreizungen beim Umgang mit HCl zu vermeiden.
   2. Geben Sie 90 μl 100 % Trichloressigsäure (TCA) in jedes Röhrchen und inkubieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang auf Eis. Durch die Ausfällung von Proteinen wird die Lösung von klar zu undurchsichtig. Wenn dies nach 30 Minuten nicht der Fall ist, kühlen Sie die Röhrchen 1 Stunde lang. Dies ist ein potenzieller Haltepunkt, und die Proben können bei Bedarf über Nacht bei 4 °C gelagert werden.
      ACHTUNG: Trichloressigsäure ist ätzend. Bitte tragen Sie bei der Handhabung Handschuhe, um Hautkontakt und Einatmen zu vermeiden.
   3. Zentrifugieren Sie die Proben bei 13.000 x g für 10 Minuten bei 4 °C. Entfernen Sie vorsichtig den TCA-Überstand, indem Sie ihn mit einer Vakuumleitung absaugen, die an einer feinen Mikropipettenspitze aus Glas befestigt ist (dieselbe Spitze kann für alle Proben verwendet werden). Stören Sie das Proteinpellet nicht, indem Sie starkes Saugen vermeiden und einen angemessenen Abstand zwischen Pipettenspitze und Pellet einhalten.
   4. Pellet schnell mit 100 μl -20 °C Aceton waschen. Dieser Schritt entfernt alle verbleibenden TCA aus dem Pellet, die den nachfolgenden Bradford-Assay beeinträchtigen können. Aceton beginnt jedoch, das Proteinpellet aufzulösen, wenn es zu lange in Kontakt bleibt, daher sollte Aceton hinzugefügt und dann innerhalb von 5 Sekunden schnell aus dem Pellet extrahiert werden.
   5. Lassen Sie Aceton verdampfen, indem Sie die Röhrchen in einen Abzug oder Kühlschrank legen. Lösen Sie dann das Proteinpellet auf, indem Sie 1 ml 0,1 M NaOH in jedes Röhrchen geben. Das vollständige Auflösen des Pellets kann mehrere Erhitzungsrunden in einem heißen Wasserbad, Vortexen und Beschallen erfordern.
      HINWEIS: Je länger die Rohre im Abzug oder Kühlschrank sitzen und je trockener die Pellets werden, desto schwieriger ist es, sie wieder aufzulösen. Es wird empfohlen, das Pellet 30 Minuten lang zu trocknen und dann alle 10-15 Minuten auf Aceton zu prüfen, bis klar ist, dass das Aceton verdunstet ist (es sind keine Acetondämpfe nachweisbar).
4. Mischen Sie Standardlösungen, verdünnen Sie unbekannte Probenlösungen und quantifizieren Sie den Gesamtproteingehalt unbekannter Proben mit dem Bradford-Assay.
   1. Herstellung von Rinder-Immunglobulin G (IgG)-Standardlösungen gemäß den in Tabelle 1 aufgeführten Konzentrationen (lyophilisierte oder IgG-Stammlösung kann mit deionisiertem Wasser gemischt werden, um jede Konzentration zu erreichen). Standards bei 4 °C lagern. In einer 96-Well-Platte fügen Sie 160 μl jeder IgG-Standardlösung in dreifacher Ausfertigung hinzu, beginnend an der A1-Position der Well-Platte (0 μg/μl in A1-, A2-, A3-Position, 0,0125 μg/μl in den Positionen B1, B2, B3 usw.).
   2. Bereiten Sie eine verdünnte NaOH-Lösung vor, indem Sie 50 μl 0,1 M NaOH zu 950 μl destilliertem Wasser hinzufügen. Als Blind-Negativkontrolle geben Sie 60 μl dieser Lösung in dreifacher Ausfertigung (Positionen G1, G2, G3) in die Well-Platte.
   3. Bereiten Sie Verdünnungen unbekannter Proben vor, indem Sie 50 μl jeder Probenlösung zu 950 μl destilliertem Wasser in einem neuen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen hinzufügen. Geben Sie dann 60 μl jeder verdünnten Probe in dreifacher Ausfertigung in die Vertiefungsplatte, beginnend an der H1-Position. Eine 96-Well-Platte sollte die Analyse von 6 Standards, 1 Blindprobe und 25 unbekannten Proben ermöglichen, wenn sie in dreifacher Ausfertigung gelesen wird. Jede analysierte Well-Platte sollte ihren eigenen IgG-Standard und Blindproben enthalten.
   4. Geben Sie 100 μl destilliertes Wasser in alle leeren und unbekannten Probenvertiefungen. Nun sollte jede Vertiefung insgesamt 160 μl enthalten. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette (8 Kanäle) 40 μl Coomassie Brilliant Blue G-250 Proteinfarbstoff in jede Vertiefung in der ersten Spalte der Vertiefungsplatte. Mischen Sie den Farbstoff mit den Proben, indem Sie ihn mehrmals eintauchen. Wiederholen Sie den Vorgang für alle anderen Säulen und tauschen Sie die Pipettenspitzen aus, um eine Kontamination zu vermeiden.
      ACHTUNG: Coomassie Brilliant Blue G-250 ist ein Reizstoff und der Kontakt mit Haut, Augen oder Lunge sollte vermieden werden. Bitte tragen Sie Handschuhe, um Hautkontakt zu vermeiden. Wenn es zu Hautkontakt kommt, hinterlässt dieses Produkt Flecken.
   5. Verwenden Sie eine Nadel, um alle in den Vertiefungen vorhandenen Blasen zum Platzen zu bringen, da diese die Messwerte des Mikroplatten-Spektralphotometers beeinträchtigen können. Reinigen Sie die Nadel, um eine Kontamination zwischen den Vertiefungen zu vermeiden. Lassen Sie die Mikroplatte 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
   6. Zeichnen Sie mit einem Mikroplatten-Spektralphotometer die Absorptionswerte für jede Vertiefung bei 595 nm auf.

Tabelle 1. Standardkurvenberechnungen für den Assay für lösliche Proteine.Die Proteinmenge in jedem Standard wird berechnet, indem die Konzentration jedes Standards mit der Menge der Standardlösung in jeder Vertiefung (160 μl) multipliziert wird.