Kolorimetrischer Assay zur Quantifizierung von nicht-strukturellen Kohlenhydraten in pflanzlichen Geweben

1. Sammeln und Verarbeiten von Pflanzen

1. Nach der Entnahme von Pflanzenproben die Proben schockfrosten, indem das Pflanzenmaterial mit einer Pinzette in flüssigen Stickstoff getaucht und bei -80 °C gelagert wird. Wenn die entnommenen Pflanzenproben zu groß sind, um sie schockfrosten zu können, kühlen Sie die Proben schnell mit Trockeneis ab und stellen Sie sie so schnell wie möglich in einen -80 °C-Gefrierschrank. Der Makronährstoffgehalt von Pflanzenmaterial kann sich ändern, nachdem das Gewebe von der Pflanze getrennt wurde, daher ist es wichtig, Pflanzenproben so schnell wie möglich nach der Entnahme einzufrieren.
   Vorsicht: Flüssiger Stickstoff kann bei Berührung mit der Haut schwere Erfrierungen verursachen. Bitte stellen Sie sicher, dass Sie flüssigen Stickstoff in zugelassenen Behältern transportieren und während der Handhabung geeignete PSA tragen, einschließlich Kryohandschuhen, Schutzbrille, Gesichtsschutz, Schürze und einem Laborkittel.
2. Lyophilisieren Sie Pflanzenmaterial mit einem Gefriertrockner, um sicherzustellen, dass das Gewebe während der Wasserentnahme metabolisch inaktiv ist. Trocknen, bis sich die Masse der Probe stabilisiert hat, um sicherzustellen, dass das gesamte Wasser entfernt wurde.
3. Sobald die Proben getrocknet sind, mit einer Mühle oder Mühle zu einem feinen Pulver mahlen. Lagern Sie die Proben bis zur Analyse in einem Trockenschrank.

2. Assay für verdauliche Kohlenhydrate

1. Probenvorbereitung
   1. Proben jedes Gewebes, jeweils ca. 20 mg, werden in 15-ml-Glasröhrchen mit gummierten Schraubverschlüssen (100 mm Länge) gewogen. Diese Proben werden im Folgenden als unbekannte Proben bezeichnet. Beschriften Sie die Röhrchen mit einem wasserfesten Marker oder mit Beschriftungsband auf den Deckeln und notieren Sie die genaue Masse jeder Probe, da diese Informationen zur Berechnung des Kohlenhydratanteils in jeder unbekannten Probe erforderlich sind.
2. Extrahieren Sie verdauliche Kohlenhydrate aus jeder unbekannten Probe.
   1. Geben Sie 1 mL 0,1 M H₂SO₄ in jedes Röhrchen und schrauben Sie die Verschlüsse fest auf die Röhrchen. 1 Stunde in ein kochendes Wasserbad stellen.
      Vorsicht: Schwefelsäure ist sehr korrosiv. Bitte tragen Sie beim Umgang mit H₂SO₄ Handschuhe, eine Schutzbrille und eine Schürze und führen Sie diesen Schritt im Abzug durch.
   2. Kühlen Sie die Röhren in einem lauwarmen Wasserbad ab. Gießen Sie den Inhalt des Röhrchens in beschriftete 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (machen Sie sich keine Sorgen, wenn Pflanzenmaterial in den Glasröhrchen verbleibt).
   3. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 15.000 x g für 10 Minuten. Entfernen Sie die überstehende Flüssigkeit mit einer Mikropipette und geben Sie sie in neu markierte 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Die Rohre können an dieser Stelle über Nacht gekühlt werden. Wenn Sie mit dem Test fortfahren, lesen Sie Schritt 2.3.2.
3. Mischen Sie Standardlösungen und quantifizieren Sie den Gesamtgehalt an verdaulichen Kohlenhydraten unbekannter Proben.
   1. Bereiten Sie D(+)-Glukose-Standardlösungen mit den in Tabelle 1 aufgeführten Konzentrationen vor. Bereiten Sie sechs Glasreagenzgläser mit 400 μl jeder Standardlösung vor.
   2. Pipettieren Sie 15 μl jeder unbekannten Probe in ein eigenes Reagenzglas und fügen Sie jeweils 385 μl destilliertes Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 400 μl in jedem Reagenzglas zu erhalten. Geben Sie in einem Abzug 400 μl 5 % Phenol in jedes Standard- und unbekannte Probenröhrchen und pipettieren Sie dann schnell 2 ml konzentriertes H₂SO₄ in jedes Röhrchen. Berühren Sie den Inhalt des Reagenzglases nicht mit der Pipettenspitze, sondern geben Sie ihn einfach auf die Lösungsoberfläche (eine Repetitionspipette eignet sich dafür am besten).
   3. Lassen Sie die Röhrchen 10 Minuten lang inkubieren und wirbeln Sie die Röhrchen dann vorsichtig auf, um den Inhalt zu vermischen. Weitere 30 Minuten inkubieren.
      Vorsicht: Phenol und Schwefelsäure sind ätzende Reizstoffe. Zum Schutz vor Haut-, Augen- und Einatmen sollte dieser Schritt in einem chemischen Abzug mit der richtigen PSA durchgeführt werden, die Folgendes umfasst: Gesichtsschutz oder Augenbrille, Gummihandschuhe, Laborschürze und Stiefel. Das Mischen von Phenol mit Schwefelsäure führt ebenfalls zu einer exothermen Reaktion, die dazu führt, dass die Rohre heiß werden.
   4. Pipettieren Sie 800 μl Probe aus jedem Röhrchen in jede von 3 1,5 mL Semi-Mikroküvetten aus Polystyrol (3 technische Wiederholungen pro Probe). Stellen Sie das Spektralphotometer auf 490 nm ein. Kalibrieren Sie auf eine leere Küvette mit destilliertem Wasser, bevor Sie Standards oder unbekannte Proben ablesen und mit Unterbrechungen während der Probenmessungen. Lassen Sie jede Küvette durch ein Spektralphotometer laufen und zeichnen Sie die Extinktion auf. Durchschnitt der technischen Replikate für jede unbekannte Stichprobe.
      Anmerkung: In einigen Fällen können die Proben die obere Absorptionsschwelle überschreiten. Ist dies der Fall, so sind die Proben in Schritt 1.3.1 zu verdünnen. Auch Verwässerungen müssen bei späteren Berechnungen berücksichtigt werden.
   5. Berechnen Sie die durchschnittliche Extinktion für jeden Standard.
      Anmerkung: Um die Menge an verdaulichen Kohlenhydraten, die in jeder unbekannten Probe vorhanden sind, anhand der Standardkurve zu berechnen, ist es am einfachsten, die durchschnittliche Absorption jedes Standards gegen die Mikrogramm D(+)glucose in jedem Standard zu regressieren, aber man kann auch die D(+)glucosekonzentration (μg/μl) jedes Standards darstellen, wenn dies gewünscht wird. Die folgenden Berechnungen beziehen sich jedoch auf eine Standardkurve, die auf Mikrogramm und nicht auf Konzentrationen (μg/μL) basiert.
   6. Berechnen Sie die Standardkurve, indem Sie die durchschnittliche Extinktion gegen die Gesamtmenge an D(+)glucose (μg) in jeder Standardlösung darstellen. Passen Sie eine lineare Regressionslinie an diese Daten an, und verwenden Sie dann die folgende Gleichung, um die Gesamtmenge an Kohlenhydraten (μg) in jeder unbekannten Probe zu berechnen:
      M_c = (((A_x – b)/m)/(15))*1000
      M_c = μg Kohlenhydrate in der Probe
      A_x = durchschnittliche Extinktion unbekannter Probe
      b = y-Achsenabschnitt (Standard-Regressionsgerade)
      m = Steigung (Standard-Regressionsgerade)
      Der Korrelationskoeffizient dieser Linie sollte größer als 0,98 und routinemäßig nahe 0,99 liegen. Verwenden Sie dann die folgende Gleichung, um den prozentualen Anteil an Kohlenhydraten in jeder Probe zu bestimmen:
      P_c = ((M_c/1000)/(M_i))*100
      P_c =%Kohlenhydrate
      M_i = Ausgangsmasse der Probe (mg)

Tabelle 1. Berechnung der Standardkurve für den Assay verdaulicher Kohlenhydrate. Die Glukosemenge in jedem Standard wird berechnet, indem die Konzentration jedes Standards mit der Menge der Standardlösung in jedem Reagenzglas (400 μl) multipliziert