Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Luciferase-basierter Toxoplasma-Wachstumsassay
- Säen Sie menschliche Vorhautfibroblasten (HFFs) 1 Woche vor der Parasitenimpfung aus, um sicherzustellen, dass die Wirtszellen vollständig zusammenfließen. Führen Sie einen Mock-Assay in einer transparenten Platte durch, um sicherzustellen, dass die Parasiten während des gesamten Bewertungszeitraums intrazellulär bleiben.
Anmerkung: Hier wird der Assay in 96-Well-Mikroplatten durchgeführt. Je nach experimentellem Bedarf kann es auf 384- oder 1536-Well-Mikroplatten skaliert werden.
- Toxoplasma-Parasiten werden 2 Tage vor der Anwendung in konfluente HFFs überführt, indem ~0,3-0,4 ml vollständig lysierte Parasiten in einen T25-Kolben überführt werden. Inkubieren Sie infizierte Wirtszellen bei 37 °C mit 5 % CO2 für 2 Tage.
- Spritzen Sie 5x 5 ml frisch lysierter Parasiten durch eine 21-G-Sicherheitsnadel, um intrazelluläre Parasiten freizusetzen, und passieren Sie dann einen 3-μm-Filter, um Wirtszelltrümmer zu entfernen. Spülen Sie die restlichen Parasiten mit 7 ml phenolrotfreiem D10-Medium aus dem Kolben und passieren Sie den Filter erneut.
- Zentrifugieren Sie die Parasiten bei 1000 x g für 10 min bei Raumtemperatur (RT). Gießen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet in 10 mL phenolrotfreiem D10-Medium.
- Zählen Sie Parasiten mit einem Hämozytometer, um die Konzentration zu bestimmen.
- Verdünnen Sie die Parasiten auf 1 x 104 Parasiten/ml für den Wildtyp-Stamm (WT). Bei wachstumsschwachen Parasitenstämmen erhöhen Sie die Konzentration entsprechend, um einen signifikanten Anstieg der Luciferase-Signale zu beobachten.
- Aspirieren Sie Medien vorsichtig aus 96-Well-Mikroplatten, die mit HFFs vorbesiedelt sind, und inokulieren Sie 150 μl Parasitenresuspension in Wells in einem Format von drei Spalten und fünf Reihen, was drei technischen Replikaten und fünf Zeitpunkten entspricht.
- Inkubieren Sie die Mikroplatte bei 37 °C und 5 % CO2 für 4 h.
- Saugen Sie das Medium vorsichtig aus den Vertiefungen ab, um nicht eingedrungene Parasiten zu entfernen, und füllen Sie dann die Vertiefungen in jeder Reihe (mit Ausnahme der ersten Reihe) mit RT-Phenolrot-freiem Medium.
- Mischen Sie gleiche Volumina PBS und 2x Luciferase-Assay-Puffer und verdünnen Sie das Luciferase-Substrat auf 12,5 μM.
- Geben Sie 100 μl verdünntes Luciferase-Substrat in jede Vertiefung der oberen Reihe. Inkubieren Sie die Mikrotiterplatten 10 Minuten lang bei RT, damit die Zellen vollständig lysieren können.
- Messen Sie die Luciferase-Aktivität mit einem Mikroplatten-Reader. Die Einstellungen des Plattenlesers sind in Tabelle 1 aufgeführt. Jeder Messwert stellt die anfängliche Anzahl der eingedrungenen Parasiten 4 Stunden nach der Infektion dar.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.9-1.12 für jede Reihe alle 24 h für 4 Tage, ohne das Medium zu wechseln. Diese Messwerte spiegeln die Gesamtzahl der replizierten Parasiten 24 h, 48 h, 72 h und 96 h nach der Infektion wider.
- Berechnen Sie die durchschnittlichen Messwerte zu jedem Zeitpunkt und dividieren Sie sie durch die durchschnittlichen Messwerte nach 4 Stunden, um die Faltenveränderungen des Parasitenwachstums im Laufe der Zeit zu bestimmen.
- Plotten Sie die Daten mit einer Grafiksoftware.
- Um die Verdopplungszeit zu berechnen, stellen Sie die log2-Werte der Faltungsänderungen zu den einzelnen Zeitpunkten über die Inkubationszeit grafisch dar. Verwenden Sie eine lineare Regressionsfunktion, um die Steigung zu berechnen, die die Verdopplungszeit jeder Dehnung darstellt.
Tabelle 1: Einstellungen des Mikroplatten-Readers für die Messung der Luziferase-Aktivität während eines Luziferase-basierten Toxoplasma-Wachstumsassays
| Luciferase: | Endpunkt |
| Integrationszeit: | 1 Sek. |
| Filterset - Emission: | Volles Licht |
| Optik: | Nach oben |
| gewinnen: | Nr. 135 |
| Lesegeschwindigkeit: | normal |
| Verzögerung: | 100 ms |
| Lesehöhe: | 4,5 mm |
