Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Bewertung der Wirksamkeit chemischer Verbindungen zur Hemmung von Toxoplasmen
HINWEIS: Hier wird die Bewertung der Hemmung von LHVS im Toxoplasma-Wachstum als Beispiel vorgestellt. Es werden acht verschiedene Konzentrationen von LHVS getestet, und für jedes der drei biologischen Replikate werden drei technische Replikate sowohl für RHΔku80::NLuc als auch für RHΔku80Δcpl::NLuc Stämme durchgeführt.
- Vor der Parasiteninfektion seeden Sie HFFs auf 96-Well-Mikroplatten im Format von drei Reihen und neun Spalten für ein biologisches Replikat pro Verbindung und Stamm. Die Wirtszellen dürfen vor der Verwendung mindestens 7 Tage lang wachsen.
- Lassen Sie RHΔku80::NLuc und RHΔku80Δcpl::NLuc Parasiten 2 Tage vor der Anwendung passieren.
- Toxoplasma-Parasiten werden 2 Tage vor der Anwendung in konfluente HFFs überführt, indem ~0,3-0,4 ml vollständig lysierte Parasiten in einen T25-Kolben überführt werden. Inkubieren Sie infizierte Wirtszellen bei 37 °C mit 5 % CO2 für 2 Tage.
- Spritzen Sie 5x 5 ml frisch lysierter Parasiten durch eine 21-G-Sicherheitsnadel, um intrazelluläre Parasiten freizusetzen, und passieren Sie dann einen 3-μm-Filter, um Wirtszelltrümmer zu entfernen. Spülen Sie die restlichen Parasiten mit 7 ml phenolrotfreiem D10-Medium aus dem Kolben und passieren Sie den Filter erneut.
- Zentrifugieren Sie die Parasiten bei 1000 x g für 10 min bei Raumtemperatur (RT). Gießen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet in 10 mL phenolrotfreiem D10-Medium.
- Zählen Sie Parasiten mit einem Hämozytometer, um die Konzentration zu bestimmen.
- Verdünnen Sie die Parasiten auf 1 x 104 Parasiten/ml für den Wildtyp-Stamm (WT). Bei wachstumsschwachen Parasitenstämmen erhöhen Sie die Konzentration entsprechend, um einen signifikanten Anstieg der Luciferase-Signale zu beobachten.
- Resuspendieren Sie Parasiten in phenolrotfreien Medien bei 1 x 104 Parasiten/ml.
- Aspirieren Sie Medien aus einer Platte, die konfluente HFFs enthält, und inokulieren Sie jede Vertiefung mit 150 μl Parasitenresuspension. Inkubieren Sie die Mikroplatte bei 37 °C und 5 % CO2 für 4 h.
- Bereiten Sie LHVS in acht verschiedenen Konzentrationen in einem 12-Well-Reservoir durch serielle Verdünnung vor. In der Regel werden die Konzentrationen in einer seriellen Verdünnungsweise um das Dreifache verringert.
Anmerkung: Die niedrigste Konzentration wird relativ zur höchsten Konzentration um das 6.561-fache reduziert. Die Faltenänderung der Verdünnung kann aufgrund unterschiedlicher Eigenschaften der einzelnen Verbindungen entsprechend angepasst werden.
- 4 h nach der Infektion aspirieren Sie das Medium, um nicht eingedrungene Parasiten zu entfernen, und füllen Sie jede Vertiefung aus den Spalten 2-9 mit 150 μl Medium, das mit LHVS in unterschiedlichen Konzentrationen ergänzt wurde. Lassen Sie die erste Spalte mit normalem Medium gefüllt, um als unbehandeltes Steuerelement zu dienen.
- Inkubieren Sie die Mikroplatte bei 37 °C und 5 % CO2 für weitere 96 Stunden.
- Saugen Sie das Medium vorsichtig aus den Vertiefungen ab, um nicht eingedrungene Parasiten zu entfernen, und füllen Sie dann die Vertiefungen in jeder Reihe (mit Ausnahme der ersten Reihe) mit RT-Phenolrot-freiem Medium.
- Mischen Sie gleiche Volumina PBS und 2x Luciferase-Assay-Puffer und verdünnen Sie das Luciferase-Substrat auf 12,5 μM.
- Geben Sie 100 μl verdünntes Luciferase-Substrat in jede Vertiefung der oberen Reihe. Inkubieren Sie die Mikrotiterplatten 10 Minuten lang bei RT, damit die Zellen vollständig lysieren können.
- Messen Sie die Luziferase-Aktivität einzelner Vertiefungen.
- Mittelwert der Luziferase-Aktivitäten von drei technischen Replikaten aus Vertiefungen jeder einzelnen LHVS-Konzentration.
- Teilen Sie die durchschnittliche Luziferaseaktivität für jede LHVS-Konzentration durch die durchschnittliche Luziferaseaktivität, die von unbehandelten Parasiten abgeleitet wurde, um die normalisierte Luziferaseaktivität in Prozent zu berechnen.
- Plotten Sie die normierten Luziferase-Aktivitäten gegen die einzelnen LHVS-Konzentrationen mit Hilfe einer Grafiksoftware (Abbildung 1). Die Hemmung von Pyrimethamin gegen Parasitenwachstum wird ebenfalls als Kontrolle gemessen. Pyrimethamin ist ein klinisches Antibiotikum, das zur Behandlung von akuter Toxoplasmose eingesetzt wird, indem es den Folsäurestoffwechsel in Toxoplasma hemmt.
- Berechnen Sie die IC50-Werte für einzelne Verbindungen mit der in der Grafiksoftware eingebetteten Methode normalisiertes Ansprechen vs. [Inhibitor] unter dem Regressionsprogramm "Dosis-Wirkungs-Hemmung". Der IC50 wird nach folgender Formel berechnet:
Y = 100/(1 + X/IC50)
Dabei gilt: Y steht für normalisierte Luciferase-Aktivitäten infizierter Zellen unter verschiedenen Konzentrationen des Inhibitors und X für individuelle Konzentrationen des Inhibitors.
