β-Galactosidase-Assay zur Bewertung der arzneimittelinduzierten Zytotoxizität bei Parasiten

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Alonso, V. L. et al. In vitro Wirkstoffscreening gegen alle Lebenszyklusstadien von Trypanosoma cruzi unter Verwendung von Parasiten, die β-Galactosidase exprimieren. J. Vis. Exp. (2021)

In diesem Video beschreiben wir eine einfache und robuste Methode zur Bestimmung des zytotoxischen Potenzials eines Trypanozid-Medikaments gegen einen Parasiten, Trypanosoma cruzi, das das Enzym β-Galactosidase exprimiert. β-Galactosidase dient als Indikator für die Zelllyse, und seine Aktivität kann verwendet werden, um die Wirkung des Medikaments zu beurteilen.

Protokoll

>1. β-Galactosidase-Assay

HINWEIS: Die Quantifizierung der β-Galactosidase-Aktivität wird als indirekte Methode zur Bestimmung der Anzahl der Parasiten verwendet. Es wird erwartet, dass das Wachstum in Gegenwart einer trypanozuden Verbindung gehemmt wird, was zu einer geringeren Anzahl von Parasiten im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle führt, was sich in einer geringeren β-Galactosidase-Aktivität und damit einer geringeren Absorption widerspiegelt.

Inkubieren Sie die Parasiten mit BZN
1. Geben Sie 100 μl der entsprechenden 2x Benznidazol (BZN)-Lösung pro Vertiefung hinzu, um eine Endkonzentration von BZN von 80, 40, 20, 10, 5 und 2,5 μM auf 100 μl Epimastigotensuspension, Vero-Zellen mit Amastigoten (2 Tage nach der Infektion) oder Trypomastigoten in einer 96-Well-Platte zu erreichen.
2. Inkubieren Sie die Epimastigoten bei 28 °C für 72 h und die Trypomastigoten oder infizierten Vero-Zellen mit Amastigoten für 24 h bei 37 °C und 5% CO₂.
  Anmerkung: Jede Arzneimittelkonzentration sollte mindestens in dreifacher Ausführung bewertet werden und Kontrollkulturen von Epimastigoten, Trypomastigoten und infizierten Vero-Zellen mit Dimethylsulfoxid (DMSO) umfassen.
Kolorimetrische Reaktion
1. Wenn sich nach der Inkubationszeit der Behandlung infizierte Vero-Zellen oder Trypomastigoten in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit Phenolrot befinden, ersetzen Sie das Medium durch 100 μl 1x PBS, um Interferenzen zu vermeiden. Führen Sie dreifache Blindvertiefungen durch, die nur 100 μl des entsprechenden Mediums (oder 1x PBS, je nach Bedarf) enthalten.
  Anmerkung: Es ist nicht notwendig, das Nährmedium für Epimastigoten im Falle von LIT-Medium oder DMEM ohne Phenolrot zu entfernen. DMEM mit Phenolrot kann weiterhin verwendet werden; Bereiten Sie eine Blindvertiefung allein mit DMEM vor, um die Basenabsorption zu messen, und subtrahieren Sie diesen Wert dann bei der Datenanalyse. Das farblose Insektenmedium von Schneider ist eine Alternative für Epimastigoten.
2. Geben Sie 40 μl Chlorphenolrot-β-D-Galactopyranosid (CPRG)-Substratlösung und 10 μl der Detergenzlösung in jede Vertiefung, um eine Endkonzentration von 200 μM CPRG und 0,1 % Detergens in einem Endvolumen von 250 μl in jeder Vertiefung zu erhalten.
  Anmerkung: Die CPRG-Lösung und das Detergens können zusammen in einem Endvolumen von 50 μl pro Vertiefung zugegeben werden.
3. h bei 37 °C inkubieren und die Extinktion bei 595 nm in einem Mikrotiterplatten-Spektralphotometer messen.
  Anmerkung: Die erwartete Farbänderung ist gelb bis rotbraun bei enzymatischer Spaltung der β-Galactosidase-Enzyme (Abbildung 1A). Die Inkubationszeit kann auf bis zu 4 h verlängert werden, und die Absorptionsspektren von Chlorphenolrot können mit ähnlicher Kurvenanpassung zwischen 570 und 595 nm abgelesen werden. Eine Inkubation von bis zu 24 Stunden in Gegenwart von CPRG-Substrat hat ähnliche Kurvenanpassungen gezeigt.

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Ergebnisse

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Abbildung 1: Berechnung des IC50-Wertes von Benznidazol für die Epimastigotenform Dm28c. (A) Eine 96-Well-Platte mit Epimastigoten, die mit unterschiedlichen BZN-Konzentrationen (2,5, 5, 10, 20, 40 und 80 μM) behandelt wurden, bevor CPRG (1), nach anfänglicher Zugabe von CPRG und Detergens (2) und nach Inkubation mit CPRG und Detergens die Farbänderung zeigte (3). (B