Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Ex-vivo endogene Monoaminfreisetzung aus Hirnschnitten oder -schlägen
HINWEIS: Das für diesen Abschnitt verwendete Gerät besteht aus einer 48-Well-Platte und einem Gewebehalter, der aus sechs Mikrozentrifugen-Filtereinheiten besteht, ohne dass die eingesetzten Filter mit einer Carbogen-Leitung verbunden sind (Abbildung 1). Verwenden Sie für die Herstellung des Halters einen stabilen Kunststoffstab (z. B. von einem Zellschaber) und kleben Sie die Mikrozentrifugenfiltereinheiten ohne die eingesetzten Filter mit Sekundenkleber darauf. 1-2 Tage trocknen lassen. Die für das endogene Monoaminfreisetzungsexperiment erforderliche Zeit und die Konzentrationen von Amphetamin, Fluoxetin und Kokain basieren auf der aktuellen Literatur und früheren Protokollen.
- Aktivierung des Gewebes
- Übertragen Sie das Hirngewebe in jede Vertiefung der Ausflusskammer und lassen Sie es 30-50 Minuten lang bei 37 °C auf einem Objektträgerwärmer in 0,5-1 ml sauerstoffreichem Effluxpuffer mit konstantem, sanftem Blasen erholen (Abbildung 1B1).
- Während dieser Inkubation verdünnen Sie die Arzneimittel auf die gewünschte Konzentration für das Experiment. Alle Arzneimittel müssen in Effluxpuffer gelöst werden, und die Konzentrationen basieren auf der aktuellen Literatur.
- Erste Inkubation
- Bringen Sie den Gewebehalter mit dem Hirngewebe in Vertiefungen mit 500 μl sauerstoffreichem Effluxpuffer und inkubieren Sie ihn 20 Minuten lang bei 37 °C. Stellen Sie sicher, dass nur minimaler bis kein Puffer transportiert wird, indem Sie auf den Halter am Rand der Vertiefung klopfen, bis sich kein überschüssiger Puffer mehr im Halter befindet.
- In Experimenten mit pharmakologischen Wirkstoffen wie Monoamin-Transporter-Inhibitoren inkubieren Sie die Gewebeproben mit den in sauerstoffreichem Effluxpuffer verdünnten Arzneimitteln (z. B. 10 μM Fluoxetin, 40 μM Kokain; siehe Abbildung 1B2). Das endgültige Volumen in jeder Vertiefung beträgt 500 μl.
- Zweite Inkubation
- Verschieben Sie den Halter mit dem Gewebe in einen neuen Satz von Vertiefungen, die 500 μl Gesamteffluxpuffer mit oder ohne die gewünschte Konzentration jedes Arzneimittels enthalten. Stellen Sie sicher, dass kein überschüssiger Puffer übrig bleibt. Jede Vertiefung stellt ein n= 1 für experimentelle Bedingungen dar. Jede Versuchsbedingung wird in dreifacher Ausfertigung ausgeführt.
- Eine Vertiefung enthält einen sauerstoffhaltigen Effluxpuffer, die nächste 10-30 μM AMPH und die letzte Vertiefung 10-30 μM AMPH plus Monoamin-Transporter-Inhibitoren. Jedes Medikament ist in sauerstoffreichem Effluxpuffer gelöst.
- Inkubieren Sie das Gewebe 20 Minuten lang bei 37 °C mit 500 μl der Arzneimittelbedingung.
Anmerkung: Zusätzliche Vertiefungen können einen sauerstoffhaltigen Puffer mit hohem K+-Efflux-Gehalt mit oder ohne die Monoamin-Transporter-Inhibitoren enthalten. Lösen Sie jedes Arzneimittel im sauerstoffhaltigen Effluxpuffer (500 μl) auf.
- Während dieser zweiten Inkubation von 20 Minuten wird die Lösung aus den Vertiefungen aus der ersten Inkubation in Schritt 1.2.1 entnommen und in Mikrozentrifugenröhrchen mit 50 μl 1 N Perchlorsäure oder Phosphorsäure umgefüllt (je nach HPLC-Typ, Endkonzentration 0,1 N). Das endgültige Volumen der Probe beträgt 550 μl. Halten Sie die Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis und beschriften Sie die Röhrchen mit #1.
- Nach der zweiten Inkubation von 20 min stellen Sie den Gewebehalter mit Hirnschnitten oder Stanzen in eine leere Vertiefung und halten die Platte auf Eis. Den Überstand in Mikrozentrifugenröhrchen mit 50 μl 1 N Perchlorsäure oder Phosphorsäure überführen. Das endgültige Volumen der Probe beträgt 550 μl. Halten Sie die Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis und beschriften Sie die Röhrchen mit #2.
- Geben Sie 1 ml eiskalten Dissektionspuffer in jede Vertiefung, die Gewebe enthält. Sammeln Sie das gesamte Gewebe mit einer kleinen Pinzette und geben Sie es in saubere Mikrozentrifugenröhrchen.
- Halten Sie die Röhrchen mit Hirngewebe bei -80 °C. Entsorgen Sie den 1 ml Dissektionspuffer (Abbildung 1B4).
- Filterlösungen, die aus jeder Inkubation mit Mikrozentrifugen-Filterröhrchen (0,22 μm) bei 2.500 x g für 2 Minuten gewonnen werden. Verwenden Sie das Filtrat, um den Monoamingehalt mittels HPLC mit elektrochemischer Detektion zu bestimmen (Abbildung 1B5).
