Kalzifizierungsassay zur Messung der Kalziumkonzentration in interstitiellen Zellen der Aortenklappe

Zusammenfassung

Quelle: Bouchareb, R. et al., Isolierung von interstitiellen Klappenzellen der Maus zur Untersuchung der Verkalkung der Aortenklappe in vitro.J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video zeigt eine Assay-Technik zur Beurteilung der Verkalkung der interstitiellen Zellen der Aortenklappe in vitro. Der Assay hilft bei der Quantifizierung der Calciumkonzentration mit dem Arsenazo III-Reagenz, einem calciumsensitiven Farbstoff, der mit Calciumionen reagiert und einen violett gefärbten Calcium-Arsenazo-Komplex bildet.

Protokoll

Alle hier beschriebenen tierischen Verfahren wurden von der Icahn School of Medicine am Mount Sinai institutionellen Kern- und Verwendungsausschuss genehmigt.

1. Vorbereitung vor der Isolierung von Ventilzellen aus adulten Mäusen

1. Reinigen und sterilisieren Sie alle in Abbildung 1A gezeigten chirurgischen Instrumente mit 70 % v/v Ethanol und autoklavieren Sie sie anschließend 30 Minuten lang. Reinigen Sie den chirurgischen Arbeitsbereich mit 70 % Ethanol.
2. Fügen Sie 500 μl Penicillin-Streptomycin zu 50 ml 10 mm HEPES hinzu. Bereiten Sie ein Aliquot von 50 mL 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor. Halten Sie die Lösungen auf Eis.
3. Bereiten Sie 1 mg/ml und 4,5 mg/ml Kollagenaselösungen vor und verwenden Sie 5 ml jeder Lösung in 15 ml-Röhrchen, um den gesamten Vorgang durchzuführen. Zur Herstellung von 5 ml 1 mg/ml Kollagenase mischen Sie 5 mg Kollagenase mit 2,5 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, fötales Rinderserum (FBS)-frei) und 2,5 ml 10 mM HEPES, ergänzt mit Antibiotika (1% Penicillin-Streptomycin aus Schritt 1.2). Die Lösungen werden durch einen 0,22 μm Filter filtriert, um jegliche Kontamination zu entfernen.
   HINWEIS: Bewahren Sie die Lösungen auf Eis auf, um die Enzyme zu schützen.
4. Erwärmen Sie die DMEM-Lösung vor der Verwendung in allen unten beschriebenen Schritten auf 37 °C. Bereiten Sie das komplette Medium vor, indem Sie DMEM mit 1 % Penicillin-Streptomycin, 1 % Natriumpyruvat, 5 ml 200 mM L-Glutamin, 1 ml Mykoplasmen-Eliminationsreagenz (siehe Materialtabelle) und 10 % FBS ergänzen.

2. Isolierung von Ventilzellen

1. Um 10⁵ Zellen für das Experiment zu erhalten, verwenden Sie fünf 8 Wochen alte Mäuse (mindestens drei). Legen Sie die Maus zusammen mit einem kleinen Stück Seidenpapier, das mit 1 ml Isofluran getränkt ist, in eine Induktionskammer, aber lassen Sie keinen Kontakt mit dem Gewebe zu. Um zu bestätigen, dass das Tier vollständig betäubt ist; Überprüfen Sie, ob der Zehenkneifreflex vorliegt, und schläfern Sie die Maus dann durch Zervixluxation ein. Verwenden Sie Isofluran, um Schmerzen vor der Gebärmutterhalsluxation zu lindern, da das unten beschriebene Verfahren tödlich ist.
2. Lege die Maus auf eine Präparierplattform und fixiere die Pfoten mit Kanülen, um sie an Ort und Stelle zu halten. Reinigen Sie die Brust und den Bauch mit Ethanol; Öffne den Bauch und die Brust mit einer Schere. Schneiden Sie mit einer kleinen chirurgischen Schere zwischen dem linken Vorhof und dem linken Ventrikel, um die Maus zu entbluten. Perfundieren Sie das Herz mit 10 ml kaltem 1x PBS, um Blut aus dem Herzen zu entfernen.
3. Schneiden Sie das Herz ab und halten Sie 3 mm Abstand zur aufsteigenden Aorta, wie in Abbildung 1B gezeigt. Präparieren Sie die Aortenklappe unter einem Stereomikroskop. Schneiden Sie das Herz horizontal in der Mitte der Ventrikel ein (Abbildung 1C). Schneiden Sie den linken Ventrikel in Richtung Aorta und präparieren Sie vorsichtig die Aortenklappe (Abbildung 1D-F). Fassen Sie die Ventile in einer kleinen 35-mm-Gewebekulturschale zusammen.
4. Waschen Sie die isolierten Ventile in einer 75-mm-Zellkulturschale mit 5 ml kaltem HEPES (10 mM), ergänzt mit Antibiotika (1 % Penicillin-Streptomycin), um Blut zu entfernen (Abbildung 2). Bereiten Sie zwei 15-ml-Röhrchen mit Kollagenase 1 mg/ml und 4,5 mg/ml vor, wie oben in Schritt 1.3.
   beschrieben Anmerkung: Manipulieren Sie nach der Dissektion die isolierten Ventile in einer sterilen Biosicherheitshaube, um die Kontamination zu minimieren.
5. Inkubieren Sie die Ventile in Kollagenase Typ I (1 mg/ml) für 30 min bei 37 °C unter ständigem Schütteln (Abbildung 2). Zentrifugieren Sie das Röhrchen 5 Minuten lang bei 150 × g, waschen Sie das Pellet einmal mit 2 mL HEPES (10 mM) und wirbeln Sie es 30 s lang bei hoher Geschwindigkeit. Gießen Sie den Inhalt dieses Röhrchens in eine 35-mm-Kulturschale und übertragen Sie die Gewebefragmente vorsichtig mit einer dünnen Pinzette in ein neues Röhrchen.
   Anmerkung: Zu diesem Zeitpunkt sind die VICs noch nicht vom Gewebe dissoziiert, und das Pellet enthält Gewebestücke. Um eine Kontamination mit Endothelzellen zu vermeiden, zentrifugieren Sie nach dem Vortexen in Schritt 2.5 nicht.
6. Inkubieren Sie das Pellet in einem 15 mL Röhrchen mit 5 mL Kollagenase Typ I (4,5 mg/mL) bei 37 °C unter kontinuierlichem Rühren für 35 min. Resuspendieren Sie die Zellen mit einer 1 mL Pipette, um die Zellen zu trennen, und zentrifugieren Sie bei 150 × g für 5 min bei 4 °C.
7. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet erneut in 2 mL vollständigem DMEM. Zentrifugieren Sie bei 150 × g für 5 min bei 4 °C. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, um die Zellen zu reinigen.
   Anmerkung: Das Pellet wird noch einige Gewebefragmente enthalten.
8. Suspendieren Sie das Pellet erneut in 1 ml vollständigem Medium und plattieren Sie die Zellen in einer Vertiefung einer 6-Well-Zellkulturschale mit einer minimalen Menge Medium, um ihre Anheftung an die Kulturschale zu erleichtern. Lassen Sie die Zellen ungestört in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid.
9. Nach 3 Tagen überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um ein gutes Wachstum in der Nähe der Gewebetrümmer zu bestätigen. Sobald 1.000 Zellen unter dem Mikroskop sichtbar sind, entfernen Sie vorsichtig die Gewebereste mit einer autoklavierten Pinzette und wechseln Sie das Medium.
   Anmerkung: Die Platte sollte nicht gestört werden; Wenn die erforderliche Anzahl von Zellen nicht eingehalten wird, stellen Sie die Zellkulturschale für weitere 2 Tage wieder in den Inkubator.
10. Wenn die Zellen zu 70% konfluent sind (2,5 × 10⁵), trypsinisieren Sie sie und übertragen sie dann in eine 75 mm Gewebekulturschale.

3. In-vitro-Kalzifizierungs-Assay

1. Reinigen Sie die Haube mit 70% Ethanol, erwärmen Sie das DMEM-Medium auf 37 °C.
2. 100.000 Zellen/Zustand in 6-Well-Platten in vollständigem DMEM aussäen und 24 Stunden lang bei 37 °C kultivieren.
3. Bereiten Sie das Verkalkungsmedium vor, indem Sie 2 mM NaH₂PO₄, 10-7 M Insulin und 50 μg/ml Ascorbinsäure in DMEM mit 5 % FBS mischen. Für 93 ml DMEM fügen Sie 5 ml FBS, 1 ml Antibiotika (Endkonzentration 1%), 1 ml Natriumpyruvat (100 mM), 27,5 mg NaH₂PO₄, 5,8 μl Insulin und 5 mg Ascorbinsäure hinzu.
   HINWEIS: Filtrieren Sie die Lösung vor Gebrauch mit einem 0,22-μm-Filter.
4. Nach 24 h den Überstand durch das Verkalkungsmedium ersetzen. Inkubieren Sie die Zellen 7 Tage lang bei 37 °C. Ersetzen Sie die Platte am 3. Tag durch frisches Verkalkungsmittel und legen Sie die Platte wieder in den Inkubator, um die 7-tägige Behandlung abzuschließen.
5. Nach 7 Tagen entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 mL 1x PBS. Die Zellen werden 24 Stunden lang bei 37 °C in 1 ml 0,6 N Salzsäure (HCl) inkubiert. Sammeln Sie das HCl in einem 1,5 ml-Röhrchen und verdampfen Sie es in einem Rotationsverdampfer. Den Inhalt aller Röhrchen in 60 μl HCl.
   Anmerkung: Der Trocknungsprozess ist wichtig, um die Lösung zu konzentrieren und für jede Bedingung das gleiche Volumen zu haben.
6. Verwenden Sie eine 96-Well-Platte, um die Kalziumkonzentration mit dem Arsenazo III-Reagenz zu messen, das in einem gebrauchsfertigen Kit erhältlich ist (weitere Informationen finden Sie in der Materialtabelle).
7. Bereiten Sie eine Calcium-Standardlösung mit einer Konzentration von 10 mg/dl vor. Wiegen Sie 10 mg Calciumhydroxid (Ca(OH)₂) und lösen Sie es in 100 ml destilliertem Wasser auf.
In einer durchsichtigen 96-Well-Platte pipettieren Sie 2 μl Blindlösung (HCl, 0,6 N), die Standardlösung, die Probe pro Vertiefung (10 mg/dl) und die Proben. Führen Sie das Experiment in dreifacher Ausfertigung durch, um die Pipettiervariabilität zu überprüfen. Fügen Sie 200 μl des Reagenzes für jede Bedingung hinzu.
Anmerkung: Proben über 15 mg/dl sollten 1:1 mit Kochsalzlösung verdünnt, erneut untersucht und das Ergebnis mit zwei multipliziert werden.
9. Inkubieren Sie die Reaktion 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
   Anmerkung: Die Reaktion ist 60 Minuten lang stabil.
10. Lesen und notieren Sie die Absorption der Platte bei 650 nm. Verwenden Sie die folgende Formel, um die Menge an Kalzium in den Proben zu berechnen:
    Calcium (mg/ml) = (Extinktion der Probe/Extinktion des Standards) × Konzentration des Standards

Ergebnisse

Abbildung 1: Beschreibung der Ventildissektion. (A) Repräsentatives Bild aller chirurgischen Instrumente, die für die Dissektion benötigt werden, die Schere 2 wird benötigt, um die Haut der Maus zu öffnen, und die Schere 3, um den Brustkorb zu öffnen. Die Pinzette 5 und 6 werden benötigt, um die Haut zu halten und die Brust zu öffnen. (B) Lassen Sie 3 mm Gewebe vo...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3 mm Schneideschere	F.S.T	Artikel-Nr.: 15000-00
Arsenazo-III Reagenzien-Set	PUNKT WISSENSCHAFTLICH	Nr. C7529-500	Ein Kit zur Messung der Kalziumkonzentration
Bonn Schere	F.S.T	Nr. 14184-09
Calciumhydroxid	SIGMA -Aldrich	Artikel-Nr.: 31219
Kollagenase Typ I (125 Einheiten/mg)	Thermofisher Scientific	17018029
DMEM	Tthermofisher	11965092
Extra feine Graefe-Pinzette	F.S.T	Nr. 11150-10
FBS	Gibco	16000044
Feine Pinzette	F.S.T. Dumont
hcl	SIGMA-ALDRICH	Nr. H1758
HEPES 1 M Lösung	STAMMZELLEN-TECHNOLOGIEN
L-Glutamin 100x	Thermofisher Scientific	A2916801
PBS 10x	SIGMA-ALDRICH
Penicillin Streptomycin 100x	Thermofisher Scientific	10378016
Natriumpyruvat 100 mM	Thermofisher Scientific	11360070
Zange mit Standardmuster	F.S.T	Nr. 11000-12
Chirurgische Schere - Sharp-Blunt	F.S.T	Nr. 14008-14
Trypsin 0,05%	Thermofisher Scientific	25300054