Immunfluoreszenz-Assay zum Nachweis von PM2,5-vermittelten DNA-Schäden in Fischembryonen

Zusammenfassung

Quelle: Huang, Y., et al. Verwendung von Immunfluoreszenz zum Nachweis von PM_{2,5-induzierten} DNA-Schäden in den Herzen von Zebrafischembryonen. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video zeigt einen hochsensitiven Immunfluoreszenz-basierten Assay zum Nachweis von PM_{2,5-induzierten} oxidativen Schäden im Herzen von Zebrafischembryonen durch Messung der Spiegel von 8-OHdG und γH2AX, die auf DNA-Schäden bzw. Doppelstrang-DNA-Brüche hinweisen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. PM_2.5 Probenahme und Extraktion organischer Verbindungen

HINWEIS: PM_2,5 wurde vom 1. bis 7. August 2015 in einem städtischen Gebiet in Suzhou, China, wie zuvor beschrieben, gesammelt.

1. 47 mm Quarzmembranfilter in einem 500 °C heißen Muffelofen für 2 h einbrennen, um die organischen Bestandteile zu entfernen.
2. Setzen Sie einen Filter in einen PM_{2,5-Probenehmer} ein, um 24 Stunden lang ununterbrochen zu entnehmen.
3. Entfernen Sie den Filter und trocknen Sie ihn 24 h lang bei Raumtemperatur.
4. Quantifizieren Sie den Filter mit einer Analysenwaage.
5. Extrahieren Sie organische Bestandteile aus dem Filter durch Soxhlet-Extraktion unter Verwendung von Dichlormethan als Lösungsmittel.
6. Trocknen Sie das EOM durch eine Rotationsverdampfung in einem 60 °C warmen Wasserbad und Stickstofffluss. EOM in DMSO auflösen und bei -20 °C lagern.

2. Entnahme und Behandlung von Zebrafischembryonen

1. Halten Sie den Zebrafisch bei 28,5 ± 0,5 °C in einem zirkulierenden Aquakultursystem mit einem 14-stündigen hellen und 10 h dunklen photoperiodischen Zyklus.
2. Setzen Sie gesunde erwachsene Zebrafische im Verhältnis 2:1 von Männchen zu Weibchen in ein Becken.
3. Am nächsten Tag entnehmen Sie die Embryonen und waschen Sie sie mit Systemwasser (z. B. Zebrafisch-Zuchtwasser).
4. Auswahl und zufällige Aufteilung von Zebrafischembryonen, die eine normale Entwicklung aufweisen (einheitliche Größe, volle Körner und keine Eigerinnung), in 4 Gruppen in einzelnen Glas-Petrischalen mit einem Durchmesser von 7 cm (ca. 50 Embryonen pro Schale).
5. Behandeln Sie die Embryonen mit PM_2,5 (5 mg/L) in Gegenwart oder Abwesenheit von NAC bei 0,25 μM von 2 hpf bis 72 hpf. Verwenden Sie DMSO als Vehikel bis zu einer Endkonzentration von 0,1 % (v/v).

3. Morphologische Beobachtung von Zebrafischembryonen und Herzdissektion

1. Bei 72 hpf werden die Embryonen auf Objektträger übertragen und unter einem Stereomikroskop betrachtet. Erfassen Sie Herzfehlbildungen wie Perikardödeme, veränderte Schleifen und verminderte Größe.
2. Berechnen Sie die Missbildungsraten (den prozentualen Anteil der Embryonen mit Herzfehlern an der Gesamtzahl der lebenden Embryonen) und analysieren Sie die Unterschiede zwischen den Gruppen mit Hilfe der Einweg-ANOVA, gefolgt vom Mehrfachvergleichstest der Türkei (p < 0,05 = statistisch signifikant).
3. Betäuben Sie die Embryonen mit 0,6 mg/ml MS-222, um sie auf Objektträgern zu immobilisieren.
4. Zeichnen Sie Herzschläge 30 s lang auf und quantifizieren Sie Herzfrequenzen mit der ImageJ-Software.
5. Präparieren Sie Herzen von Zebrafischembryonen mit einer Einwegspritzennadel unter einem Stereomikroskop. Achtung: Vermeiden Sie es, die Herzform zu zerstören.

4. Immunfluoreszenz-Assay

1. Um einen Immunfluoreszenz-Assay zum Nachweis von PM_{2,5-induzierten} DNA-Schäden im Herzen von Zebrafischembryonen zu verwenden, verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um einen Kreis auf einer sauberen Glasseite zu zeichnen.
2. Fügen Sie 50 μl 4% Paraformaldehyd zu 1,25 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hinzu, um eine Fixierlösung herzustellen.
3. Legen Sie 3 präparierte Herzen in einen hydrophoben Barrierestiftkreis und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.
4. Dekantieren Sie die Lösung unter dem Mikroskop und trocknen Sie die Proben bei Raumtemperatur für mindestens 5 min, so dass die Herzen vollständig an den Objektträgern haften.
5. Waschen Sie die Objektträger dreimal in PBS mit 0,1 % Tween 20 (PBST) für 5 min pro Waschgang.
6. Fügen Sie 50 μl Rinderserumalbumin (BSA) zu 1000 μl PBST hinzu, um eine 5%ige BSA-Lösung zu erhalten, und inkubieren Sie die Objektträger 1 h lang in einer feuchten Kammer, um die unspezifische Antikörperbindung zu blockieren.
7. Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Proben dreimal mit PBST für 5 min pro Waschgang.
8. Verdünnen Sie 2 μl monoklonalen Maus-Antikörper gegen 8-OHdG und 2 μl polyklonalen Kaninchen-Antikörper gegen γH2AX in 296 μl PBST, um eine funktionierende primäre Antikörper-Cocktail-Lösung zu erhalten.
9. Die Herzproben werden mit 50 μl der primären Antikörper-Cocktaillösung gegen 8-OHdG und γH2AX in einer befeuchteten Kammer mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubiert (eine Inkubation über Nacht kann die Signalintensität erhöhen).
10. Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Proben dreimal mit PBST für 5 min pro Waschgang.
11. Verdünnen Sie 1 μl des FITC-markierten Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörpers und 1 μl des cy3-Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörpers in 498 μl PBST, um eine funktionierende Sekundärantikörper-Cocktaillösung zu erhalten, und inkubieren Sie die Proben mit den Sekundärantikörpern (1:500 in PBST) für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
12. Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Proben dreimal pro Waschgang 5 Minuten lang lichtgeschützt mit PBS.
13. 20 μl DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol) werden zu den Proben für die Kernfärbung für 30 Minuten bei Raumtemperatur gegeben.
14. Tragen Sie ein Deckglas auf das Gleiten auf und versiegeln Sie es mit Nagellack, um ein Austrocknen und Verrutschen zu verhindern. Anschließend werden die Proben unter einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet und das Fluoreszenzsignal des Herzbereichs mit der ImageJ-Software quantifiziert. Berechnen Sie die relativen Änderungen mit dem Durchschnitt der DMSO-Kontrollstichproben. Ermitteln Sie die statistische Signifikanz der Daten wie in Schritt 3.2.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
8-OHdG-Antikörper	Santa Cruz Biotechnologie, USA	SC-66036	Primärer Antikörper
Analytische Waage	Sartorius,China	BSA124S
Bsa	Solarbio, Peking, China	SW3015	Zum Blockieren
DAPI	Abcam, Vereinigte Staaten von Amerika	Artikel-Nr.: ab104139	Für nukleare Gegenbeizen.
Dmso	Solarbio, Peking, China	Nr. D8371
Fluoreszenz-Mikroskop	Olympus, Japan	IX73	Zur Abbildung von Fluoreszenzsignalen
Anti-Kaninchen IgG Cy3	Carlsbad, Vereinigte Staaten von Amerika	KW0159	Sekundärer Antikörper
Ziege Anti-Kaninchen IgG FITC	Carlsbad, Vereinigte Staaten von Amerika	RS0003	Sekundärer Antikörper
N-Acetyl-L-cystein (NAC)	Adamas-Beta, Shanghai, China	Artikel-Nr.: 616-91-1
Orbital-Shaker	QILINBEIER,China	TS-1
Paraformaldehyd	Sigma, China	Nr. P6148	Stellen Sie 4% Paraformaldehyd zur Fixierung her.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	HyClone, Vereinigte Staaten von Amerika	SH30256.01	0,1 % Tween in PBS zum Waschen vorbereiten.
PM2.5-Probenehmer	TianHong, Wuhan, China	TH-150C	Für eine ununterbrochene 24-Stunden-PM2,5-Probenahme.
Rezirkulierendes Aquakultursystem	HaiSheng,Shanghai,China		Darin wurde der Zebrafisch gehalten.
Soxhlet-Extraktor	ZhengQiao,Shanghai, China	BSXT-02	Für die Extraktion organischer Bestandteile.
stereomikroskop	Nikon, Kanada	SMZ645	Für die Herzdissektion von Zebrafischembryonen.
Tricain-Methansulfonat (MS222)	Sigma, China	Nr. E10521	Zur Betäubung von Zebrafischembryonen
Tween 20	Sigma, China	Nr. P1379
γH2AX Antikörper	Abcam, Vereinigte Staaten von Amerika	Artikel-Nr.: ab26350	Primärer Antikörper