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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Vorbereitung von Schnitten aus dem rhinalen Kortex und dem Hippocampus
HINWEIS: Für die Herstellung von rhinalen Cortex-Hippocampus-Schnitten werden P6-7 Sprague-Dawley-Ratten verwendet.
- Aufbau der Kultur und Vorbereitung des Mediums
- Bereiten Sie am Tag vor der Kultur die benötigten Medien vor und stellen Sie sie auf 4 °C.
- Bereiten Sie das Seziermedium vor: 25 mM Glukose in Gey's Balanced Salt Solution (GBSS).
- Nährmedium vorbereiten: 50 % Opti-MEM, 25 % HBSS, 25 % Pferdeserum (HS), 25 mM Glukose, 30 μg/ml Gentamycin.
- Erhaltungsmedium vorbereiten: Neurobasal-A (NBA), 2 % B27, 1 mM L-Glutamin, 30 μg/ml Gentamycin, HS (15 %, 10 %, 5 % und 0 %).
- Brain-Harvesting
- Geben Sie kurz vor Beginn der Kultur 1,1 ml Nährmedium mit einer P1000-Pipette in jede Vertiefung der 6-Well-Platte und stellen Sie sie auf 37 °C.
- Legen Sie alle Geräte (Präpariermikroskop, Gewebezerkleinerer, Präparierlampe, Präparierwerkzeuge, Elektroden, Platten, Einsätze und Filterpapiere) in die biologische Sicherheitswerkbank und sterilisieren Sie sie 15 Minuten lang unter UV-Licht.
- Stellen Sie die Schichtdicke auf 350 μm ein.
- GBSS aus dem Kühlschrank nehmen. Geben Sie 5 ml GBSS in sechs Petrischale. Pro Tier werden sechs Petrischalen benötigt.
- Euthanasiere den Rattenwelpen. Führen Sie die Enthauptung mit einer scharfen Schere an der Basis des Hirnstamms des Tieres durch.
- Waschen Sie den Tierkopf dreimal in kaltem GBSS und bringen Sie ihn in den Sicherheitsschrank.
- Gewebeisolierung und Vorbereitung von Scheiben
- Führen Sie eine scharfe Pinzette fest in die Augenhöhlen ein, um den Kopf zu halten.
- Schneiden Sie mit einer dünnen Schere die Haut/Kopfhaut entlang der Mittellinie beginnend vom Foramen vertebrale in Richtung der Frontallappen und legen Sie sie beiseite.
- Schneiden Sie auf die gleiche Weise den Schädel und entlang der zerebralen Querfissur (Raum zwischen Gehirn und Kleinhirn). Bewegen Sie die gebogene lange Pinzette auseinander.
- Entsorgen Sie die Riechkolben mit einem Spatel. Entfernen Sie das Gehirn aus dem Kopf und legen Sie es mit der Rückenfläche nach oben in ein eiskaltes GBSS (Abbildung 1A).
- Führen Sie die feine Pinzette in das Kleinhirn ein und gehen Sie mit dem Spatel entlang der Mittellinie, um jede Hemisphäre sehr vorsichtig zu öffnen (Abbildung 1B).
- Entfernen Sie mit einer kurzen Kurvenzange vorsichtig das überschüssige Gewebe, das die Hippocampus bedeckt, ohne die Hippocampusstruktur zu berühren. Schneiden Sie dann mit einem Spatel unter jeden Hippocampus (Abbildung 1C).
- Nehmen Sie eine Halbkugel und legen Sie sie mit dem Hippocampus nach oben auf ein Filterpapier. Wiederholen Sie den Vorgang mit der anderen Hemisphäre und legen Sie sie parallel zur ersten in das Filterpapier. Legen Sie das Filterpapier mit den Halbkugeln senkrecht zur Klinge auf den Zerkleinerer und schneiden Sie die Halbkugeln in 350 μm große Scheiben (Abbildung 1D).
- Legen Sie das geschnittene Gewebe in eine Petrischale mit kaltem GBSS (Abbildung 1E).
- Trennen Sie die Scheiben vorsichtig mit den Elektroden mit runder Spitze (Abbildung 1F). Behalten Sie nur die Scheiben mit einer strukturell intakten Rinde und Hippocampus. Die DG- und CA-Bereiche sollten perfekt definiert sein, ebenso wie der entorhinale und perirhinale Kortex (Abbildung 1G).
- Legen Sie jede Scheibe mit einem Spatel und einer Elektrode mit runder Spitze auf den Einsatz (Abbildung 1H-I). Entfernen Sie überschüssiges Dissektionsmedium um jede Scheibe herum mit einer P20-Pipette (Abbildung 1J). Vier rhinale Cortex-Hippocampus-Schnitte können in einem einzigen Insert kultiviert werden (Abbildung 1K).
- Kulturpflege
- Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag.
- Das Medium auf 37 °C erwärmen.
- Nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator. Nehmen Sie jeden Einsatz auf, indem Sie die Kunststoffkante mit einer Pinzette festhalten (Abbildung 1L).
- Verwenden Sie eine freie Hand, um das Medium aus der Vertiefung zu aspirieren. Setzen Sie den Einsatz wieder in die Vertiefung ein und fügen Sie mit einer P1000-Pipette 1 ml frisches, erwärmtes Medium hinzu (Abbildung 1M). Wiederholen Sie den Vorgang für alle Einfügungen. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen zwischen der Membran und dem Medium eingeschlossen sind.
Anmerkung: Epileptische Schnitte werden einem allmählichen und kontrollierten Entzug des Serums im Medium unterzogen. Ab 9 Days In Vitro (DIV) werden Slices in NBA ohne HS gepflegt.
2. Elektrophysiologische Aufzeichnungen
HINWEIS: Elektrophysiologische Aufzeichnungen wurden in organotypischen Schnitten des rhinalen Kortex-Hippocampus bei 7, 14 und 21 DIV in einer grenzflächenartigen Kammer durchgeführt. Die Aufnahmen wurden mit einem Verstärker aufgenommen, digitalisiert und mit einer Software analysiert. Alle Aufnahmen wurden bandpassgefiltert (achtpoliges Bessel-Filter bei 60 Hz und Gauß-Filter bei 600 Hz).
- Vorbereitung der Einrichtung
- Bereiten Sie 50 ml NBA-Medium mit 1 ml B27 und 250 μl L-Glutamin vor. Bei 37 °C aufwärmen.
- Stellen Sie den elektrophysiologischen Aufbau in einen geschlossenen Kreislauf ein. Überprüfen Sie, ob die Flussrate 2 ml/min beträgt.
- Öffnen Sie das Ventil der Carbox (5 % CO2 / 95 % O2) und prüfen Sie den Wasserstand im System.
- Legen Sie das Filterpapier in die Aufnahmekammer der Schnittstelle, um überschüssiges Medium abzulassen, und das Reinigungspapier der Linse unter den Rahmen, um die Scheibe mit Medium zu versorgen.
- Schalten Sie den Temperaturregler, die Verstärker und den Mikromanipulator ein.
- Lassen Sie die Temperatur in der Interface-Kammer auf 37 °C stabilisieren, bevor Sie mit den Aufnahmen beginnen.
- Bereiten Sie künstliches Liquor (aCSF: 124 mM NaCl, 3mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 10 mM Glukose, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4 mit pH 7,4) vor und füllen Sie damit die Glaselektrode mit einer Spritze. Platzieren Sie es in der Empfangselektrode.
- Aufzeichnungen von spontanen Aktivitäten
- Sobald die Temperatur stabil ist, nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und schneiden Sie mit einer sehr scharfen Klinge eine Scheibe aus dem Einsatz. Legen Sie es in eine 60 mm dicke Platte mit einem Tropfen Medium. Bringen Sie es in die Aufnahmekammer des Interfaces.
- Platzieren Sie die Scheibe in der Grenzfläche mit dem Hippocampus nach rechts unten. Platzieren Sie die Empfangselektrode in der pyramidalen Zellschicht CA3.
- Fahren Sie mit dem kontinuierlichen Erfassungsprotokoll fort und nehmen Sie 30 Minuten lang auf.
