Neuronaler Todestest zur Bewertung des Zelltods im ex vivo Epilepsiemodell

Zusammenfassung

Quelle: Carvalho, M., et al., Ein Modell der Epileptogenese in organotypischen Schnittkulturen des rhinalen Cortex-Hippocampus. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video demonstriert die Technik zur Beurteilung des neuronalen Todes in organotypischen Schnitten des rhinalen Kortex-Hippocampus. Der neuronale Tod erfolgt durch sich entwickelnde epileptische Anfälle – ähnlich der In-vivo-Epilepsie – und wird durch doppelte Färbung der toten Zellen mit Propidiumiodid und Immunfluoreszenz nachgewiesen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Vorbereitung von Schnitten aus dem rhinalen Kortex und dem Hippocampus

HINWEIS: Für die Herstellung von rhinalen Cortex-Hippocampus-Schnitten werden P6-7 Sprague-Dawley-Ratten verwendet.

1. Aufbau der Kultur und Vorbereitung des Mediums
   1. Bereiten Sie am Tag vor der Kultur die benötigten Medien vor und stellen Sie sie auf 4 °C.
   2. Bereiten Sie das Seziermedium vor: 25 mM Glukose in Gey's Balanced Salt Solution (GBSS).
   3. Nährmedium vorbereiten: 50 % Opti-MEM, 25 % HBSS, 25 % Pferdeserum (HS), 25 mM Glukose, 30 μg/ml Gentamycin.
   4. Erhaltungsmedium vorbereiten: Neurobasal-A (NBA), 2 % B27, 1 mM L-Glutamin, 30 μg/ml Gentamicin, HS (15 %, 10 %, 5 % und 0 %).
2. Brain-Harvesting
   1. Geben Sie kurz vor Beginn der Kultur 1,1 ml Nährmedium mit einer P1000-Pipette in jede Vertiefung der 6-Well-Platte und stellen Sie sie auf 37 °C.
   2. Legen Sie alle Geräte (Präpariermikroskop, Gewebezerkleinerer, Präparierlampe, Präparierwerkzeuge, Elektroden, Platten, Einsätze und Filterpapiere) in die biologische Sicherheitswerkbank und sterilisieren Sie sie 15 Minuten lang unter UV-Licht.
   3. Stellen Sie die Schichtdicke auf 350 μm ein.
   4. GBSS aus dem Kühlschrank nehmen. Geben Sie 5 ml GBSS in sechs Petrischale. Pro Tier werden sechs Petrischalen benötigt.
   5. Euthanasiere den Rattenwelpen. Führen Sie die Enthauptung mit einer scharfen Schere an der Basis des Hirnstamms des Tieres durch.
   6. Waschen Sie den Tierkopf dreimal in kaltem GBSS und bringen Sie ihn in den Sicherheitsschrank.
3. Gewebeisolierung und Vorbereitung von Scheiben
   1. Führen Sie eine scharfe Pinzette fest in die Augenhöhlen ein, um den Kopf zu halten.
   2. Schneiden Sie mit einer dünnen Schere die Haut/Kopfhaut entlang der Mittellinie beginnend vom Foramen vertebrale in Richtung der Frontallappen und legen Sie sie beiseite.
   3. Schneiden Sie auf die gleiche Weise den Schädel und entlang der zerebralen Querfissur (Raum zwischen Gehirn und Kleinhirn). Bewegen Sie die gebogene lange Pinzette auseinander.
   4. Entsorgen Sie die Riechkolben mit einem Spatel. Entnehmen Sie das Gehirn aus dem Kopf und legen Sie es mit der Rückenfläche nach oben in ein eiskaltes GBSS (Abbildung 1A).
   5. Führen Sie die feine Pinzette in das Kleinhirn ein und gehen Sie mit dem Spatel entlang der Mittellinie, um jede Hemisphäre sehr vorsichtig zu öffnen (Abbildung 1B).
   6. Entfernen Sie mit einer kurzen Kurvenzange vorsichtig das überschüssige Gewebe, das die Hippocampus bedeckt, ohne die Hippocampusstruktur zu berühren. Schneiden Sie dann mit einem Spatel unter jeden Hippocampus (Abbildung 1C).
   7. Nehmen Sie eine Halbkugel und legen Sie sie mit dem Hippocampus nach oben auf ein Filterpapier. Wiederholen Sie den Vorgang mit der anderen Hemisphäre und legen Sie sie parallel zur ersten in das Filterpapier. Legen Sie das Filterpapier mit den Halbkugeln senkrecht zur Klinge auf den Zerkleinerer und schneiden Sie die Halbkugeln in 350 μm große Scheiben (Abbildung 1D).
   8. Legen Sie das geschnittene Gewebe in eine Petrischale mit kaltem GBSS (Abbildung 1E).
   9. Trennen Sie die Scheiben vorsichtig mit den Elektroden mit runder Spitze (Abbildung 1F). Behalten Sie nur die Scheiben mit einer strukturell intakten Rinde und Hippocampus. Die DG- und CA-Bereiche sollten perfekt definiert sein, ebenso wie der entorhinale und perirhinale Kortex (Abbildung 1G).
   10. Legen Sie jede Scheibe mit einem Spatel und einer Elektrode mit runder Spitze auf den Einsatz (Abbildung 1H-I). Entfernen Sie überschüssiges Dissektionsmedium um jede Scheibe herum mit einer P20-Pipette (Abbildung 1J). Vier rhinale Cortex-Hippocampus-Schnitte können in einem einzigen Insert kultiviert werden (Abbildung 1K).
4. Kulturpflege
   1. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag.
   2. Das Medium auf 37 °C erwärmen.
   3. Nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator. Nehmen Sie jeden Einsatz auf, indem Sie die Kunststoffkante mit einer Pinzette festhalten (Abbildung 1L).
   4. Verwenden Sie eine freie Hand, um das Medium aus der Vertiefung zu aspirieren. Setzen Sie den Einsatz wieder in die Vertiefung ein und fügen Sie mit einer P1000-Pipette 1 ml frisches, erwärmtes Medium hinzu (Abbildung 1M). Wiederholen Sie den Vorgang für alle Einfügungen. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen zwischen der Membran und dem Medium eingeschlossen sind.
      Anmerkung: Epileptische Schnitte werden einem allmählichen und kontrollierten Entzug des Serums im Medium unterzogen. Ab 9 Days In Vitro (DIV) werden Slices in NBA ohne HS gepflegt.

2. PI-Aufnahme-Assay

HINWEIS: Der Zelltod wurde durch Überwachung der zellulären Aufnahme des Fluoreszenzfarbstoffs Propidiumiodid (PI) bewertet. PI ist eine polare Verbindung, die in Zellen mit geschädigten Zellmembranen eindringt und mit der DNA interagiert, die rote Fluoreszenz emittiert (Absorption 493 nm, Emission 630 nm). Da PI nicht für lebende Zellen bestimmt ist, wird es verwendet, um tote Zellen in einer Population zu erkennen.

1. PI-Inkubation
   1. Bereiten Sie in Kulturmedium eine frische 1:10-Verdünnung des PI-Materials vor.
   2. Für den PI-Aufnahmetest nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und heben Sie den Einsatz vorsichtig an. Geben Sie 13 μl PI mit einer P20-Pipette in das Medium, um eine Endkonzentration von 2 μM zu erreichen. Rühren Sie die Platte langsam um, bevor Sie den Einsatz wieder einsetzen. Achten Sie darauf, dass sich keine Blasen unter den Scheiben befinden.
   3. Legen Sie die Scheiben für 2 h wieder in den 37 °C heißen Inkubator.
   4. Fahren Sie mit dem immunhistochemischen Protokoll fort, wie im nächsten Abschnitt beschrieben. Decken Sie die Platten mit Aluminium ab, da PI lichtempfindlich ist.

3. Immunhistochemie

HINWEIS: In der Immunhistochemie wurden ein neuronenspezifischer Antikörper sowie Antikörper, die ruhende und reaktive Phänotypen von Mikroglia und Astrozyten unterscheiden können, verwendet, um das Ausmaß des neuronalen Todes und der Gliose in epileptischen organotypischen Schnitten des rheinischen Kortex-Hippocampus zu bewerten.

1. Fixierung des Gewebes
   1. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und saugen Sie das Medium an. Fixieren Sie die Scheiben 1 h lang mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) bei RT, indem Sie mit einer P1000-Pipette 1 mL PFA unter und über den Scheiben hinzufügen.
   2. Entfernen Sie das PFA und fügen Sie 1 ml PBS hinzu. Fügen Sie außerdem PBS unter und über den Scheiben hinzu.
   3. Die Scheiben bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C in PBS aufbewahren. Legen Sie immer Parafilm um die Platten, um ein Austrocknen zu vermeiden.
2. Schritte zur Immunfärbung
   1. Zweimal waschen, jeweils 10 Minuten, mit 1 ml PBS.
   2. Bereiten Sie eine Permeabilisierungs-/Blockierungslösung vor, die 1 % Triton-X100, 10 % HS und 10 % BSA in PBS enthält. Bereiten Sie 5%ige BSA-Lösung vor.
   3. Zeichnen Sie mit dem hydrophoben Stift zwei Rechtecke (Abbildung 2A). Schneiden Sie die Scheiben mit einer sehr scharfen Klinge aus der Einlage (Abbildung 2B). Legen Sie zwei Scheiben pro Objektträger (Abbildung 2C) und geben Sie mit einer P200-Pipette 140 μl Permeabilisierungs-/Blockierungslösung auf jede Scheibe. 3 Stunden bei RT inkubieren.
   4. Verdünnen Sie die Primärantikörper auf die Arbeitsverdünnung in 5 % BSA in PBS. Mit den Primärantikörpern über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   5. Inkubieren Sie mit den Sekundärantikörpern für 4 h bei RT. Schützen Sie die Platte ab diesem Schritt vor Licht, da mit Fluorophoren gearbeitet wird.
   6. Geben Sie einen 50-μl-Tropfen Hoechst-Lösung auf jede Scheibe und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei RT.
   7. Zwischen den Inkubationen waschen. Waschen Sie immer dreimal für jeweils 10 Minuten mit PBS-T.
   8. Hoechst herausnehmen und wie empfohlen waschen.
   9. Geben Sie 50 μl Eindeckmedium auf die Oberseite jeder Scheibe. Mit einem Glasdeckglas abdecken und mit Nagellack umranden (Abbildung 2D).
   10. 24 h bei RT trocknen lassen.
   11. Visualisieren Sie die Immunfärbung unter einem konfokalen Mikroskop. Bewahren Sie die fleckigen Scheiben bei -20 °C auf.

Ergebnisse

Abbildung 1: Detailliertes Verfahren zur Präparation von organotypischen Schnitten aus dem rheinischen Kortex-Hippocampus. (A) Entfernen Sie das Gehirn aus dem Kopf und legen Sie es mit der Rückenfläche nach oben in ein eiskaltes GBSS. (B) Führen Sie die Pinzette in das Kleinhirn ein. Öffnen Sie das Gehirn durch die Mittellinie und entfernen Sie das überschüssige Gewebe über dem Hippocampus. (

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
50 mL Zentrifugenröhrchen, konischer Boden	Corning	430829
70% Ethanol	Manuel Vieira, Lda	UN1170
Anti-NeuN (Kaninchen)	Werfen	Artikel-Nr.: 16712943S	Im Verhältnis 1:500 verdünnen
B-27™ Supplement (50X), serumfrei	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 17504-044
Klingen für Skalpellgriff	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Artikel-Nr.: 10011-00
Rinderserumalbumin (BSA)	NZYTech	MB04602	5% BSA wird verwendet, um die primären Antikörper zu verdünnen. Fügen Sie 0,5 g BSA in 10 mL PBS hinzu.
-/Gewebe-Scheibenkammer-System	Warner Instruments
Zellkultureinsätze, 30 mm, hydrophiles PTFE	Millipore SAS	PICM03050
Kaltlichtquelle	Schott	KL 300 LED
Konfokales Lasermikroskop	Zeiss	LSM 710
Konventioneller Inkubator	Thermo Scientific Heraeus	BB15, Funktionslinie	Eingestellt auf 37 °C und 5 % CO2
D(+)-Glukose-Monohydrat	Merck Millipore	Artikel-Nr.: 1.08342.1000
D-(+)-Glukoselösung, 45% in Wasser	Sigma	Nr. G8769
di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat	Merck Milipore	Artikel-Nr.: 1.06580.1000
Präpariermikroskop/Lupe	MEIJI TECHNO CO. LTD	122285
Esel-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) gekoppelt an Alexa Fluor 488	Invitrogen	Nr. A21206	Im Verhältnis 1:500 verdünnen
Dumont #5 Feine Pinzette Biologie Inox	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 11254-20
Dumont #5 Pinzette Standard Inox	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 11251-20
Dumont #7 Pinzette Standard Dumoxel	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 11271-30
Dumont Medical #7S Pinzette Short Curve Inox	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 11273-22
Gentamycin-Stammlösung, 50 mg/ml	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 15750-037
Geys ausgewogene Salzlösung (GBSS)	Biologische Industrien	01-919-1A
Glas-Elektroden	Wissenschaftliche Produkte	GB150F-10	Runde Spitzen selbstgemacht
Glas-Pasteur-Pipetten, 230 mm	VWR Deutschland	Nr. 612-1702
Hank's Ausgewogene Salzlösung (HBSS)	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 24020-091
Pferdeserum, hitzeinaktiviert (HS)
Salzsäure	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 26050-088
Hydrophober Stift	Merck Milipore	Artikel-Nr.: 1.09057.1000
INCU-Linie IL10	Dako	S200230-2
Irisspatel gebogen	Warner Instruments	BSC-HT Haas Top
Biologische Sicherheitswerkbank der Laborkulturklasse II	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 10092-12
Reinigungspapier für Linsen	HERASafe	HS 12
L-Glutamin Lösung 200 mM (Q)	VERSTEIFUNG
Mikroröhrchen 0,5 mL, PP	Merck Millipore	Artikel-Nr.: 1.05886.0500
Mikroröhrchen 1,5 mL, PP	SARSTEDT	72.699
Mikroröhrchen 2,0 mL, PP	SARSTEDT	72.690.001
Miroscope Deckbrille, 24 mm x 60 mm	Sutter-Instrument	MP-285
Nagellack	Marienfeld	102242
Neurobasal-A Medium (NBA)	Klischee
Opti-MEM® I Reduziertes Serummedium	Thermo Fisher Scientific	Tel.: 10888-022
Paraformaldehyd, Pulver	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 31985-047
Peristaltische Pumpe	VWR Chemikalien	2,87,94,295
Phosphat-Kochsalzpuffer (PBS)	Gilson	M312
Phosphat-Standardlösungen, PO43- in Wasser			selbstgemacht. PBS mit 0,5 % Tween-20 (PBS-T) wird zum Waschen der Scheiben während des immunhistochemischen Assays verwendet.
Pipetten-Set	BDH ARISTAR	Artikel-Nr.: 452232C
Platin 5 Klingen	Gilson	P2, P10, P20, P100, P200, P1000
Propidiumiodid (PI)	Sigma-Aldrich	Nr. 5405-250g
Qualitatives Filterpapier, Zellulose, Güteklasse 1, 55 mm	Sigma-Aldrich	Nr. P4170-25MG	Stammlösung mit 1 mg/ml in Wasser.
Qualitatives Filterpapier, Zellulose, Güteklasse 1, 90 mm	Whatman	Nr. 1001-055	Mittlerer Rückhalt 11μm
Skalpell-Griff	Whatman	Nr. 1001-090	Mittlerer Rückhalt 11μm
Slip Tip Insulinspritze ohne Nadel 1 mL	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Artikel-Nr.: 91003-12
Schülerschere Gerade SharpSharp 12cm	Astro Med Inc GRASS Produktgruppe	S48 Stimulator
SuperFrost Plus™ Adhäsionsfolien	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Artikel-Nr.: 91402-12
TC-behandelte sterile 60 x 15 mm Gewebekulturschale	Thermo Fisher Scientific	J1800AMNZ
TC-behandelte sterile 6-Wells-Platten	Corning	CORN430166
Zerkleinerer für Gewebe	MEDICAL SYSTEMS CORP.	TC-102
Triton X-100	Das Mickle Laboratory Engineering CO. LTD.	MTC/2	Auf 350 μm eingestellt
Tween-20	BDH	Artikel-Nr.: 14630
	Sigma	Nr. P2287

Gehirn kg kg kg