PolyQ Aggregation Assay zur Identifizierung der neuroprotektiven Wirkung einer Substanz in Würmern

Zusammenfassung

Quelle: Wang, Q. et al. Caenorhabditis elegans als Modellsystem für die Entdeckung bioaktiver Verbindungen gegen Polyglutamin-vermittelte Neurotoxizität. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video beschreibt eine in vivo Methode zum Screening des Schutzpotenzials von neuroprotektiven Testsubstanzen bei der Reduzierung der PolyQ-Aggregation in Körperwandmuskelzellen von Nematoden und zur Verbesserung der Aggregations-assoziierten Proteotoxizität

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Protokoll

1. PolyQ Aggregations-Assay

1. Aufbereitung von Nematoden für den polyQ Aggregationsassay
   1. Übertragen Sie 300-500 synchronisierte L1-Larven von AM141 in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte mit 500 μl S-Medium, das OP50 (OD₅₇₀ von 0,7-0,8) und 5 mg/ml Astragalan enthält, typischerweise eine Vertiefung pro Behandlung für einen Zeitpunkt.
   2. Versiegeln Sie die Platte mit Parafilm und inkubieren Sie sie bei 20 °C und 120 U/min für 24, 48, 72 und 96 h.
   3. Ernten Sie die Nematoden in einem sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und waschen Sie sie >3-mal durch Zentrifugation mit M9-Puffer (1000 × g für 1 min), um das restliche OP50 zu entfernen. Suspendieren Sie die AM141-Nematoden im M9-Puffer und halten Sie sie für die Bildaufnahme bereit.
2. Aufnahme von Fluoreszenzbildern und Datenanalyse
   HINWEIS: Die Daten werden mit diesem High-Content-Imaging-System automatisch analysiert. Wenn ein automatisiertes Bildgebungsgerät nicht verfügbar ist, kann eine herkömmliche Methode zur Vorbereitung eines Agarose-Pads für die Bildaufnahme verwendet werden, um eine ähnliche Leistung unter Verwendung eines herkömmlichen Fluoreszenzmikroskops zu erzielen.
   1. Übertragen Sie 10-15 Nematoden in eine 384-Well-Platte in jede Vertiefung (Endvolumen 80 μl pro Vertiefung). Legen Sie für jede Behandlung 10 Replikationsvertiefungen fest.
   2. Geben Sie 10 μl 200 mM Natriumazid in jede Vertiefung, um die Nematoden zu lähmen und sie am Boden absetzen zu lassen (5-10 Minuten).
   3. Platzieren Sie die Platte in einem High-Content-Bildgebungssystem, um Fluoreszenzbilder aufzunehmen (Informationen zu Geräten und Software finden Sie in der Materialtabelle).
   4. Öffnen Sie die Bildaufnahmesoftware und richten Sie die folgenden Parameter ein.
      1. Öffnen Sie das Fenster "Plattenerfassung einrichten" und erstellen Sie ein neues Experimentierset und einen neuen Namen.
      2. Wählen Sie "Vergrößerung" als 2x, "Kamera-Binning" als 1 und "Plattentyp" als 384-Well-Platte aus.
      3. Legen Sie die Brunnen und Standorte (einzelner Standort) fest, die besucht werden sollen.
      4. Wählen Sie den Filter Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) aus und aktivieren Sie die bildbasierten Fokussierungsoptionen.
      5. Stellen Sie die Belichtung auf 300 ms.
         Anmerkung: Die oben genannten Einstellungen können getestet und angepasst werden, um die Bildgebungsparameter zu optimieren.
      6. Speichern Sie die Bildaufnahmeeinstellungen und klicken Sie auf die Schaltfläche Capture Plate, um es auszuführen.
   5. Analysieren Sie die Bilddaten mit der Bildanalysesoftware.
      1. Öffnen Sie das Fenster Plattendaten überprüfen und wählen Sie die Testplatte für die Bildanalyse aus.
      2. Doppelklicken Sie auf eine Testvertiefung, um ihr Bild anzuzeigen.
      3. Wählen Sie die Anzahl der Kerne als Analysemethode aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Einstellungen konfigurieren, um ein Fenster für die folgenden Einstellungen aufzurufen.
      4. Definieren Sie das Quellbild aus dem FITC-Kanal und wählen Sie den Standardalgorithmus aus.
      5. Stellen Sie die Bildanalyseparameter wie folgt ein: ungefähre minimale Breite = 10 μm (= 2 Pixel); ungefähre maximale Breite = 50 μm (= 12 Pixel); Intensität über lokalem Hintergrund = 1.000-2.000 Graustufen.
      6. Testen Sie die aktuellen Einstellungen, um die Analysemethode zu optimieren.
      7. Speichern Sie die Einstellungen und führen Sie die Analyse für alle Vertiefungen aus.
         Anmerkung: Es dauert ~20 Minuten, bis die Analyse für eine 384-Well-Platte abgeschlossen ist.
      8. Exportieren Sie die Gesamtkerne als Gesamtzahl der Q40::YFP-Aggregate in jedem Well.
   6. Zähle die Anzahl der Nematoden in jeder Vertiefung.
   7. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl von Q40::YFP-Aggregaten pro Nematode in jeder Gruppe, und wenden Sie eine nichtlineare Kurvenanpassung auf die Daten von jedem Zeitpunkt an.
   8. Berechnen Sie den Hemmindex:
      Inhibitionsindex = (_{N Kontrolle} - N_Probe) / Ncontrol
      Dabei sind N_Kontrolle und_{N Probe} die durchschnittliche Anzahl von Q40::YFP-Aggregaten in der Kontroll- bzw. der Behandlungsgruppe.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
C. elegans-Stamm
AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP]	Caenorhabditis Genetikzentrum (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/AM141
E. coli-Stamm
OP50	Caenorhabditis Genetikzentrum (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
Reagenz
Natriumazid	Verifizierter Lieferant - Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd.	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd
Ausrüstung
384-Well-Zellkulturplatte	Verifizierter Lieferant - Nest Biotechnology Co., Ltd.	761001	https://www.cell-nest.com/page94? _l=de&product_id=85
48-Well-Zellkulturplatte	Verifizierter Lieferant - Nest Biotechnology Co., Ltd.	748001	https://www.cell-nest.com/page94? _l=de&product_id=85
Fluoreszenz-Mikroskop	Verifizierter Lieferant - Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.	Mshot MF31-LED	https://www.mshot.com/ article/442.html
High-Content-Imaging-System	Molekulare Bauelemente	ImageXpress	https://www.moleculardevices.com/ Produkte/zelluläre-bildgebungssysteme#High-Content-Imaging
Mikrozentrifuge	GeneCompany	GENESPEED X1	https://www.genecompany.com/ index.php/Home/Waren/ goodsdetails/gid/189.html
Parafilm M	Sigma-Aldrich	Nr. P7793-1EA	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
Mikroskop-Digitalkamera	Verifizierter Lieferant - Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.	MS60	https://www.mshot.com/article/677.html
Software
Software zur Bilderfassung und -analyse	Molekulare Bauelemente	MetaXpress	https://www.moleculardevices.com/ Produkte/Cellular-Imaging-Systeme/ Erfassungs- und Analysesoftware/ Metaxpress