Ein Assay zur Untersuchung der Wirkung der Testsubstanz gegen PolyQ-vermittelte Neurotoxizität bei Würmern

Zusammenfassung

Quelle: Wang, Q. et al., Caenorhabditis elegans als Modellsystem für die Entdeckung bioaktiver Verbindungen gegen Polyglutamin-vermittelte Neurotoxizität. J. Vis. Exp. (2021)

In diesem Video beschreiben wir eine Methode zur Bewertung der neuroprotektiven Wirkung einer Testsubstanz, Astragalan, auf das neuronale Überleben bei Caenorhabditis elegans durch polyQ-vermittelte Neurotoxizität. Der Assay verwendet Caenorhabditis elegans, die die abnormal expandierten polyQ-Wiederholungen exprimieren, die mit GFP in ihren ASH-Neuronen fusioniert sind, um das neuronale Überleben nach der Behandlung mit der Testsubstanz zu messen.

Protokoll

1. PolyQ-vermittelter Neurotoxizitätstest

1. Behandlung von C. elegans mit Testproben
   1. Zur Vorbereitung von Nematoden für den polyQ-Neurotoxizitätstest werden 300-500 synchronisierte L1-Larven von HA759 in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte mit 500 μl S-Medium mit OP50 (OD₅₇₀ von 0,7-0,8) und 5 mg/ml Astragalan übertragen; typischerweise drei Replikatvertiefungen für jede Behandlung.
   2. Verschließen Sie die Platte mit Parafilm und inkubieren Sie sie 3 Tage lang bei 15 °C und 120 U/min.
   3. Sammeln Sie die Nematoden durch Zentrifugation und waschen Sie sie 3-5 Mal mit M9-Puffer. Resuspendieren Sie die Nematoden im M9-Puffer zur Verwendung in neuronalen Überlebens- und Vermeidungsassays.
2. Zubereitung des Agarose-Pads
   1. Geben Sie 2 g Agarose zu 100 mL M9-Puffer (2 % w/v) und erhitzen Sie die Agaroselösung in einer Mikrowelle bis zum Siedezustand.
   2. Geben Sie 0,5 mL geschmolzene Agarose auf die Mitte eines 1 mm dicken Objektträgers, der zwischen zwei 2 mm dicken Glasplatten platziert wird. Mit einer weiteren Folie vertikal abdecken. Sobald die Agarose abgekühlt und fest geworden ist, entfernen Sie vorsichtig den oberen Objektträger.
3. ASH-Überlebensassay für neuronale Anwendungen
   1. Geben Sie einen Tropfen 20 mM Natriumazid auf das Agarose-Pad. Übertragen Sie 15-20 HA759-Nematoden in den Tropfen, um sie zu immobilisieren.
   2. Legen Sie vorsichtig ein Deckglas über die Nematoden. Bewahren Sie den Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop auf, das mit einer Digitalkamera ausgestattet ist. Wählen Sie eine 40-fach-Objektivlinse und einen FITC-Filter, um GFP-positive ASH-Neuronen im Kopfbereich der Nematoden zu erkennen.
   3. Wählen Sie mehr als 50 Nematoden in jeder Gruppe nach dem Zufallsprinzip aus, um die Anzahl der Nematoden mit GFP-markierten bilateralen ASH-Neuronen in ihrer Kopfregion zu zählen. Berechnen Sie die Überlebensrate von ASH-Neuronen:
      Neuronales Überleben (%) =
      Dabei sind N_Überleben und N_gesamt die Anzahl der Nematoden mit GFP-positiven ASH-Neuronen bzw. die Gesamtzahl der getesteten Nematoden in jeder Gruppe.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
C. elegans-Stamm
HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)]	Caenorhabditis Genetikzentrum (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/HA759
E. coli-Stamm
OP50	Caenorhabditis Genetikzentrum (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
Reagenz
Agarose	Biowest (Biowesten)	Artikel-Nr.: 111860
Natriumazid	Verifizierter Lieferant - Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd.	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd
Ausrüstung
48-Well-Zellkulturplatte	Verifizierter Lieferant - Nest Biotechnology Co., Ltd.	748001	https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
Fluoreszenz-Mikroskop	Verifizierter Lieferant - Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.	Mshot MF31-LED	https://www.mshot.com/article/442.html
High-Content-Imaging-System	Molekulare Bauelemente	ImageXpress Pico	https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging
Mikrozentrifuge	GeneCompany	GENESPEED X1	https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html
Mikroskop-Digitalkamera	Verifizierter Lieferant - Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.	MS60	https://www.mshot.com/article/677.html
Mikrowelle	Midea Corp.	M1-211A	https://www.midea.cn/10000/10000000001
Parafilm M	Sigma-Aldrich	Nr. P7793-1EA	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
Software
Software zur Bilderfassung und -analyse	Molekulare Bauelemente	MetaXpress	https://www.moleculardevices.com/ Produkte/Cellular-Imaging-Systeme/ Erfassungs- und Analysesoftware/ Metaxpress