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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für die Rezepte der Lösungen, die in diesem Protokoll verwendet werden.
>1. Vorbereitung der Materialien für den Caenorhabditis elegans-Test
- Pflege von C. elegans-Stämmen
- Beziehen Sie die Stämme C. elegans (AM141 und HA759) und Escherichia coli (OP50 und NA22) (siehe Materialtabelle).
- Halten Sie die Nematoden auf der mit E. coli OP50 besiedelten Nematoden-Wachstumsmedienplatte (NGM) bei 20 °C für AM141 oder 15 °C für HA759.
- Vorbereitung der Bakterienkultur E. coli OP50
- Entnehmen Sie eine einzelne Kolonie von E. coli OP50 aus einer Luria-Bertani (LB) Streifenplatte und inokulieren Sie sie in 50 ml flüssige LB-Kultur.
- Inkubieren Sie die OP50-Bakterien in einem Shaker bei 37 °C und 200 U/min bis zu einer optischen Dichte von ~0,5 bei 570 nm (OD570).
- Lagern Sie die OP50-Bakterienkultur bei 4 °C und verwenden Sie sie innerhalb von zwei Wochen.
- Vorbereitung von NGM-Platten mit OP50-Bakterien
- Geben Sie 20 g Agar, 2,5 g Pepton, 3,0 g NaCl und 975 ml deionisiertes Wasser in eine autoklavierbare 1-Liter-Flasche. Autoklav bei 121 °C für 30 min.
- Stellen Sie die flüssige NGM-Agarflasche auf die Bank, um sie auf ~60 °C abzukühlen, und fügen Sie dann die folgenden sterilen Stammlösungen hinzu: 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 5 mg/ml Cholesterin und 25 ml 1 M Kaliumphosphat (pH 6,0).
- Gießen Sie 20 mL NGM in eine sterile 90-mm-Petrischale und lassen Sie die Platten auf der Bank abkühlen und fest werden. Bewahren Sie die Platten auf dem Kopf auf und lassen Sie sie 2 Tage lang bei Raumtemperatur auf der Werkbank trocknen.
- Geben Sie 200 μl der OP50-Bakterienkultur auf jede NGM-Platte und verteilen Sie sie gleichmäßig mit einem sterilen Glasbeschichtungsstab. Schließen Sie die Deckel und inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C.
- Lagern Sie die mit OP50 besiedelten NGM-Platten in einer Kunststoffbox mit Deckel bei Raumtemperatur und verbrauchen Sie sie innerhalb von zwei Wochen.
- Vorbereitung einer alterssynchronisierten C. elegans-Population
- Sammeln Sie trächtige adulte Nematoden in einem sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie 1 Minute lang bei 1000 × g. Waschen Sie die Nematoden dreimal und resuspendieren Sie sie in M9-Puffer.
- Geben Sie die gleiche Menge Bleichlösung hinzu und rühren Sie sie 3-5 Minuten lang leicht um. Überwachen Sie das Bleichen alle 15 s unter einem Präpariermikroskop.
Anmerkung: Die Bleichlösung muss vor der Verwendung frisch zubereitet werden, indem gleiche Volumina von 10 % NaOCl und 1 M NaOH gemischt werden (Tabelle 1).
- Sobald die meisten Nematoden gebrochen sind, stoppen Sie die Verdauung, indem Sie sie mit M9-Puffer verdünnen. Schnell zentrifugieren, um den Überstand zu entfernen, und das Pellet in M9-Puffer resuspendieren, um das Waschen dreimal zu wiederholen.
- Resuspendieren Sie das Pellet in S Medium. Lassen Sie die Nematodenreste 2-3 Minuten lang durch die Schwerkraft absetzen, während die Eier im Überstand verbleiben.
- Der Überstand wird in ein neues steriles Mikrozentrifugenröhrchen abgesaugt. Die Eier durch Zentrifugation bei 1000 × g für 1 min sammeln.
- ~80 % des Überstands werden verworfen und die Eier in einen sterilen Kolben mit 20 ml S-Medium gegeben. Stellen Sie den Kolben in einen Schüttler und inkubieren Sie die Eier über Nacht ohne Nahrung bei 120 U/min, um synchronisierte L1-Nematoden zu erhalten.
2. PolyQ-vermittelte Neurotoxizitäts-Assays
- Behandlung von C. elegans mit Testproben
- Zur Vorbereitung von Nematoden für den polyQ-Neurotoxizitätstest werden 300-500 synchronisierte L1-Larven von HA759 in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte mit 500 μl S-Medium mit OP50 (OD570 von 0,7-0,8) und 5 mg/ml Astragalan übertragen, typischerweise drei Replikatvertiefungen für jede Behandlung.
- Verschließen Sie die Platte mit Parafilm und inkubieren Sie sie 3 Tage lang bei 15 °C und 120 U/min.
- Sammeln Sie die Nematoden durch Zentrifugation und waschen Sie sie 3-5 Mal mit M9-Puffer. Resuspendieren Sie die Nematoden in M9-Puffer zur Verwendung in neuronalen Überlebens- und Vermeidungsassays.
Osmotischer Vermeidungsassay
- Teilen Sie eine lebensmittelfreie NGM-Platte (9 cm) durch eine 8 M Glycerin (~30 μL) Linie in der Mitte in eine normale (N) und Trap (T) Zone. Verteilen Sie eine 200 mM Natriumazidlinie (~20 μL) in einem Abstand von ~1 cm von der Glycerinlinie, um die Nematoden zu lähmen, die durch die Glycerinbarriere in Zone T gelangen.
- Übertragen Sie jeweils ~200 Nematoden auf Zone N mit drei Replikatplatten für jede Gruppe. Geben Sie einen Tropfen 1% Butandion (~2 μl) auf Zone T (1 cm vom Plattenrand entfernt), um die Nematoden anzulocken. Decken Sie den Deckel der Petrischale sofort ab und inkubieren Sie sie 90 Minuten lang bei 23 °C.
- Bewerten Sie die Anzahl der Nematoden in den N- und T-Zonen unter einem Mikroskop. Berechnen Sie den Vermeidungsindex mit Gl.
Vermeidungsindex = N / (T + N)
Dabei sind N und T die Anzahl der Nematoden in N- bzw. T-Zonen. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung (SD) von drei Replikaten dargestellt, die repräsentativ für >3 unabhängige Experimente sind.
- Führen Sie einen ungepaarten, zweiseitigen t-Test durch, um die Daten der Astragalan- und der Kontrollgruppe zu vergleichen.
Tabelle 1:
| Lösung | Hinweise zur Zubereitung | Lagerung |
| 1 M CaCl2 | 111 g CaCl2 | Bei Raumtemperatur lagern (RT) |
| dH2O bis 1 L hinzufügen |
| Autoklav |
| 1 M Kaliumphosphat (pH 6,0) | 108,3 g KH2PO4 | Bei RT speichern |
| 35,6 K2HPO4 |
| dH2O bis 1 L hinzufügen |
| Autoklav |
| 1 M MgSO4 | 246 g MgSO4,7H 2O | Bei RT speichern |
| dH2O bis 1 L hinzufügen |
| Autoklav |
| Cholesterin in Ethanol (5 mg/ml) | 0,5 g Cholesterin | Bei -20 °C lagern |
| Ethanol auf 100 mL geben |
| Nicht autoklavieren! |
| 1 M Kaliumcitrat (pH 6,0) | 10,0 g Zitronensäure-Monohydrat zugeben | Bei RT speichern |
| 146,75 g Tri-Kalium-Zitronensäure-Monohydrat zugeben |
| dH2O bis 1 L hinzufügen |
| Autoklav |
| Lösung für Spurenmetalle | 0,93 g Dinatrium EDTA | Dunkel bei RT lagern |
| 0,345 g FeSO4,7H 2O |
| 0,1 g MnCl2,4H 2O |
| 0,145 g ZnSO4,7H 2Ω |
| 0.0125 g CuSO4,5H 2O hinzufügen |
| Fügen Sie dH2O zu 500 mL hinzu |
| Autoklav |
| 1 M NaOH | 4 g NaOH | Bei RT speichern |
| Fügen Sie dH2O zu 100 mL hinzu |
| Bleichlösung | 0,5 mL von 1 M NaOH | Vor Gebrauch frisch zubereiten |
| 0,5 mL von 10 % NaOCl |
| M9 Puffer | 5 g NaCl | Bei RT speichern |
| 3 g KH2PO4 |
| 6 g Na2HPO4 |
| dH2O bis 1 L hinzufügen |
| Autoklav |
| 1 mL von 1 M MgSO4 zugeben |
| S basal | 5,85 g NaCl | Bei RT speichern |
| 6,0 g KH2PO4 |
| 1,0 g K2HPO4 |
| Fügen Sie dH2O zu 973 mL hinzu |
| Autoklavieren und abkühlen auf ~60 °C |
| Fügen Sie 1 ml 5 mg/ml Cholesterin in Ethanol hinzu |
| S mittel | S basal | Bei RT speichern |
| Fügen Sie 3 mL von 1 M CaCl2 hinzu |
| Zugabe von 3 mL von 1 M MgSO4 |
| Fügen Sie 10 ml 1 M Kaliumcitrat hinzu |
| Fügen Sie 10 ml Spurenmetalllösung hinzu |
| Alle Komponenten wurden autoklaviert, nicht autoklavieren |
| 5 mg/ml Astragalan | 0,1 g Astragalan | In Aliquoten bei -80 °C lagern |
| Fügen Sie 20 mL S Medium hinzu |
| Filtern Sie durch 0,22 μm Spritzenvorsatzfilter |
| 200 mM Natriumazid | 1,3 g NaN3 | Bei 4 °C lagern |
| Fügen Sie 100 mL S Medium hinzu |
| 8 M Glycerin | 73,67 g Glycerin | Bei RT speichern |
| Fügen Sie dH2O zu 100 mL hinzu |
| 10% Butandion-Aktien | Mischen Sie 10 μl Butandion mit 90 μl dH2O | Bei RT shoppen |
| 1% Butandion | Addieren Sie 10 μl Butandion-Stamm zu 90 μl dH2O | Bei RT shoppen |
| 1 L der Luria-Bertani (LB) Kultur | 10 g NaCl | Bei RT speichern |
| 10 g Trypton |
| 5 g Hefe-Extrakt |
| dH2O bis 1 L hinzufügen |
| Autoklav |