Wundassay zur Bewertung der Migrationskapazität von murinen Myoblasten in Co-Kultur

Zusammenfassung

Quelle: Toubat, O. et al., Modellierung der parakrinen nichtkanonischen Wnt-Signalgebung in vitro. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video beschreibt einen berührungslosen Co-Kultur-Wundheilungsassay, um die Migrationskapazität von murinen Myoblasten zu bewerten. Dies hilft, die signalsendenden und signalempfangenden Komponenten der parakrinen nicht-kanonischen Wnt-Signalwechselwirkungen in vitro zu verstehen.

Protokoll

1. Untersuchung von Wunden:

(Abbildung 1 zeigt das schematische Modell des Assays)

1. Lassen Sie die O9-1-Zelleinsätze und die C2C12-Zellkammer-Wells im Inkubator anhaften und proliferieren, bis beide Zellen eine Konfluenz von ~70-80 % erreicht haben, bevor Sie mit diesem Teil des Protokolls fortfahren. Wenn Zellen >90 % konfluent wachsen, fahren Sie nicht mit dem Scratch-Assay fort, da sich die Zellen lediglich von der Vertiefung lösen.
2. Erwärmen Sie 1x PBS und C2C12 Medium, indem Sie sie in ein 37 °C warmes Wasserbad legen.
3. Entfernen Sie das überstehende Medium aus der C2C12-Kammervertiefung und waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS. Entfernen Sie das 1x PBS und kratzen Sie die Zellen sofort mit einer sterilen P10-Pipettenspitze an.
   1. Führen Sie die sterile P10-Pipettenspitze fest in eine einzige Richtung, um die gesamte Länge oder Breite der Zellmonoschicht zu überspannen (z. B. von rechts nach links, von oben nach unten). Achten Sie darauf, jede Vertiefung mit Zellen nur einmal zu zerkratzen.
      Anmerkung: Um die Scratching-Ergebnisse zu optimieren, scratchen Sie Wells mit unterschiedlichen experimentellen Bedingungen bei ähnlichem Konfluenzniveau. Stellen Sie dazu sicher, dass jede 4-Kammer-Vertiefung Zellen für jede erforderliche experimentelle Bedingung enthält (z. B. Vertiefung #1 Negativkontrolle, Vertiefung #2 Positivkontrolle). Verwenden Sie außerdem für jeden Kratzer eine neue sterile P10-Pipette und üben Sie jedes Mal eine ähnliche Kraft auf die Pipette aus. Versuchen Sie nicht, mehr als einen Kratzer in jeder Vertiefung zu erzeugen.
   2. Geben Sie nach dem Kratzen mit einer P1000-Pipettenspitze schnell 1 ml 1x PBS zurück in die Vertiefung. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Vertiefung, die zerkratzt werden soll.
      Anmerkung: Angesichts der Variabilität, die mit jedem Kratzer verbunden ist, wird empfohlen, in jeder Versuchsbedingung mehrere Vertiefungen (n = 3) für die Wundbildung zu verwenden. Arbeiten Sie zügig, da es wichtig ist, die Dauer zu minimieren, für die die Zellen während dieser Schritte ohne 1x PBS sind. Nach der Entnahme von 1x PBS aus jeder Vertiefung sollte man nicht länger als 5 s brauchen, um in jeder Vertiefung eine Wunde zu erzeugen.
4. Nachdem Sie eine Wunde erzeugt und 1x PBS wieder in jede Vertiefung gegeben haben, bilden Sie den Kratzer mit einem inversen Hellfeldmikroskop ab und verwenden Sie dieses Bild als Basiswundgröße (Zeit 0). Um Bilder aufzunehmen, führen Sie die folgenden Schritte aus:
   1. Schalten Sie den Computer und das Mikroskop (siehe Materialtabelle) ein, indem Sie den Netzschalter drücken. Platzieren Sie den Kammerschlitten auf dem Tisch und drehen Sie das Objektivrad auf 5-fache Vergrößerung.
   2. Öffnen Sie die Imaging-Software (siehe Materialtabelle), indem Sie auf das Software-Symbol auf dem Computer-Desktop doppelklicken. Klicken Sie auf dem Startbildschirm der Software auf die Registerkarte Kamera. Klicken Sie auf die Schaltfläche Live, um die Zellen auf der Registerkarte AxioCam IC zu visualisieren.
   3. Stellen Sie sicher, dass der Lichtfilter ganz herausgezogen ist, damit das Licht auf die Kamera und den Computerbildschirm gelangen kann. Bewegen und/oder drehen Sie den Kammerschieber manuell, um den gewickelten Bereich in der Mitte des Live-Bildes auf der Registerkarte AxioCam IC zu positionieren.
   4. Um Bilder aufzunehmen, klicken Sie auf Einrasten, um eine neue Registerkarte neben der AxioCam IC-Registerkarte zu öffnen, die das Bild enthält.
   5. Um dieses Standbild zu speichern, klicken Sie oben links auf der Startseite der Software auf Datei | Speichern unter | Geben Sie den Dateinamen in das Feld für den Dateinamen ein. Speichern Sie die Figur im Carl Zeiss-Bildformat (*.czi) (die Standardeinstellung) und wählen Sie Desktop in der linken Leiste, um die Datei als .czi-Datei auf dem Desktop zu speichern, die nur im Softwareprogramm Zen lite 2012 geöffnet werden kann.
   6. Um das Bild als .tiff zu speichern, klicken Sie auf Datei | Speichern unter | Dateinamen eingeben in das Feld Dateiname. Speichern Sie die Figur als getaggte Bilddatei (*.tiff), indem Sie auf die Schaltfläche Dateityp klicken und *.tiff aus dem Dropdown-Menü auswählen.
      Anmerkung: Das .tiff Format kann in jeder Bildbearbeitungssoftware geöffnet werden.
   7. Positionieren Sie den Kammerschieber manuell neu, um 2-3 weitere Bilder an anderen Stellen der Wunde in derselben Vertiefung aufzunehmen.
      Anmerkung: Insgesamt ergibt dies 3-4 nicht überlappende Bilder der Wunde mit hoher Vergrößerung in jeder Vertiefung
   .
5. Entfernen Sie 1x PBS aus jeder Vertiefung und fügen Sie 1 ml C2C12-Medium hinzu.
   Anmerkung: Achten Sie darauf, nicht zu aggressiv zu pipettieren, wenn Sie nach der Wunderzeugung Lösungen aus der Kammervertiefung entfernen oder in die Kammervertiefung geben, da dies dazu führen kann, dass sich Zellen aus der Vertiefung der Kammer lösen. Kippen Sie außerdem die Vertiefung der Kammer, so dass die Aspiration und Wiedereinführung der Lösungen an den Ecken jeder Vertiefung erfolgen kann, um die Störung der Zellmonoschicht zu minimieren.
6. Bauen Sie das Well-Insert-Kokultursystem zusammen, indem Sie die Einsätze mit den O9-1-Zellen manuell in jede Vertiefung der Kammer-Well einsetzen. Schieben Sie die Einsätze vorsichtig nach unten in die Vertiefung, so dass der Boden des Einsatzes knapp über den darunter liegenden C2C12-Zellen sitzt. Bringen Sie die Vertiefungseinsatzkonstrukte in den Inkubator zurück.
   Anmerkung: Lassen Sie nicht zu, dass die Unterseite des Einsatzes die darunter liegenden C2C12-Zellen berührt und mechanisch zerstört.
7. Lassen Sie die Zellen insgesamt 9-12 Stunden wandern. Um die optimale Migrationszeit zu bestimmen, überprüfen Sie die Zellen 6 Stunden nach der Wundbildung und danach alle 2-3 Stunden. Beenden Sie das Experiment, wenn die Zellen unter Kontroll- oder Positivkontrollbedingungen beginnen, die Wunde vollständig zu bedecken.
   Anmerkung: Aufgrund der berührungslosen Natur des Konstrukts muss der darüber liegende Einsatz bei der Überprüfung des Verlaufs der Intervallmigration nicht aus den Vertiefungen entfernt werden. Die Variabilität der Migration wird in Abhängigkeit von Faktoren wie den in diesem Assay verwendeten Zelltypen, der Zelldichte zum Zeitpunkt der Wundbildung, der Breite der erzeugten Wunde und den experimentellen Bedingungen manipulierter Zellen (z. B. Gen-Knockdown, rekombinante Proteinzufügung) beobachtet. Die Konzentrationen dieser Reagenzien sollten experimentell unter Berücksichtigung der Empfehlungen des Herstellers bestimmt werden.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematisches Modell des Assays.Schritt 1 umfasst die in vitro Expansion von C2C12-Myoblasten und NCCs mit Hilfe von STO-Feeder-Zellen. Schritt 2 umfasst die Beschichtung von NCCs und C2C12-Zellen im Kokultursystem. Schritt 3 umfasst den Wundassay, der in darunter liegenden C2C12-Zellen durchgeführt wird, um die zelluläre Migrationskapazität zu bewerten. Schritt 4 umfasst die...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
C2C12 murine Myoblasten-Zelllinie	ATCC	CRL-1772
Kammer-Schiebesystem, 4-fach	ThermoFisher Scientific	154526
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), hoher Glukosegehalt (4,5 g/L), Lglutamin (2 mM)	Corning	10-017-CV	Lagerung bei 4 °C
Graduierte und sterile Pipettenspitzen, 10 μL	USA Wissenschaftlich	Tel.: 1111-3810
O9-1 Neuralleisten-Zelllinie	Millipore Sigma	Artikel-Nr.: SCC049
Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS), 1x, ohne Calcium und Magnesium, pH 7,4	Corning	21-040-CV	Lagerung bei 4 °C
Falcon permeable Halterung für 24-Well-Platte mit 0,4 μM transparenter PET-Membran	Corning	353095
Fötales Rinderserum	Fisher Scientific	W3381E	Lagerung in 50 mL Aliquots bei -20 °C
Zeiss inverses Lichtmikroskop Axio Vert.A1	Carl Zeiss AG
Zen lite 2012 Mikroskopie-Software	Carl Zeiss AG		Bildgebungssoftware