Enzyme-Linked Immunosorbent Assay zur Verifizierung chemisch gekoppelter Antikörper-Antigen-Konjugate

Zusammenfassung

Quelle: Volckmar, J. et al., Chemische Konjugation eines gereinigten DEC-205-gerichteten Antikörpers mit vollwertigem Protein für dendritische Zellen der Maus in vitro und in vivo. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video demonstriert den Nachweis von chemisch konjugierten Antikörper-Antigen-Komplexen mit Hilfe der Sandwich Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Technik. Der eingefangene Antikörper bindet an das spezifische Epitop des Antigens des Antikörper-Antigen-Konjugats, das später mit einem enzymgebundenen Sekundärantikörper sichtbar gemacht werden kann.

Protokoll

1. Herstellung von αDEC-205 aus der Hybridom-Zelllinie NLDC-145

1. Für die Antikörperproduktion tauen kryokonservierte NLDC-145-Zellen, die αDEC-205 produzieren, bei 37 °C in einem Wasserbad auf. Expandieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO₂. Zwei 75 cm² große Flaschen werden benötigt, um mit der Antikörperproduktion fortzufahren. Zellkulturverfahren sollten in einer Sicherheitswerkbank durchgeführt werden, um sichere Arbeitsbedingungen zu gewährleisten und eine Kontamination der Kulturen zu verhindern.
   1. 1 ml aufgetaute Zellen (1 x 10⁶ - 5 x 10⁶ Zellen/ml) in 9 ml ISF-1-Medium, ergänzt mit 1 % Penicillin/Streptomycin (vorgewärmt auf 37 °C) in einen Zellkulturkolben (25 cm²) resuspendieren. Der Kolben wird horizontal in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 °C, 5 % CO₂ gestellt.
   2. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO₂ bis zu 70 % Konfluenz. Dies sollte in der Regel nach 24 - 48 h erreicht sein.
   3. Sobald die Zellen zu 70 % konfluent sind, übertragen Sie die gesamte NLDC-145-Zellsuspension (10 ml) in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen unter Verwendung einer Pipettiersteuerung mit einer Pipette in einem Volumenbereich von 1-10 ml. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 250 x g für 10 min bei Raumtemperatur pelletiert.
   4. ISF-1-Medium in einem Wasserbad auf 37 °C vorwärmen und das Pellet in 12 ml ISF-1-Medium, zugegeben mit 1 % Penicillin/Streptomycin, resuspendieren. Die resuspendierte Zellsuspension wird in einen frischen Zellkulturkolben (75 cm²) überführt.
   5. Kultivieren und expandieren Sie die Zellen in ISF-1-Medium, das mit 1 % Penicillin/Streptomycin bei 37 °C und 5 % CO₂ ergänzt wird, bis 70 % konfluent und 99 % lebensfähig sind. Dies sollte in der Regel nach 48 - 72 h erreicht sein.
   6. Die Zellen werden in zwei 75 cm² Kolben aufgeteilt. Spülen Sie dazu zunächst den Boden des Zellkulturkolbens/die Kulturoberfläche mit der Zellsuspension, um alle NLDC-145-Zellen von der Oberfläche zu entfernen. Jeweils 6 ml der NLDC-145-Zellsuspension in eine von zwei frischen 75 cm² Flaschen umfüllen und vorgewärmtes ISF-1-Medium, ergänzt mit 1 % Penicillin/Streptomycin, bis zu 12 ml.
      Anmerkung: Erneuern Sie das Zellkulturmedium nicht, da die NLDC-145-Zellen das Medium konditioniert haben. Übertragen Sie die Zellen zusammen mit ihrem Medium und füllen Sie die Kultur bis zum gewünschten Volumen mit frischem Medium. Dies ist entscheidend für die Lebensfähigkeit und maximale Antikörperproduktion durch die NLDC-145-Zellen.
   7. Expandieren Sie die Zellkulturen bei 37 °C und 5% CO₂, bis etwa 70% konfluent, was in der Regel nach 48 - 72 h erreicht wird.
   8. Sobald die Zellen zu 70 % konfluiert sind, übertragen Sie 10 ml der expandierten NLDC-145-Zellsuspension aus jeder der 75 cm² Flaschen in eine PETG-Walzflasche (Polyethylenterephthalatglykol) (1.050 cm²). Spülen Sie dazu den Boden des Zellkulturkolbens/die Kulturoberfläche mit der Zellsuspension, um alle Zellen mit einer Pipettierhilfe und einer 10-ml-Pipette von der Oberfläche zu entfernen.
   9. 140 ml ISF-1-Medium, ergänzt mit 1 % Penicillin/Streptomycin (vorgewärmt auf 37 °C), direkt aus der Mediumflasche in jede der NLDC-145-Rollerflaschen geben und bis zur 150-ml-Marke füllen.
      Anmerkung: Siehe Hinweis in Schritt 1.1.6.
   10. Kulturieren Sie die Rollerflaschen drei Tage lang bei 37 °C, 5 % CO₂ und 25 Umdrehungen/min.
   11. 150 ml ISF-1-Medium, ergänzt mit 1 % Penicillin/Streptomycin (vorgewärmt auf 37 °C), in jede der NLDC-145-Rollerflaschen geben und bis zur 300-ml-Marke füllen.
   12. Kultivieren Sie die Rollerflaschen, die nun jeweils 300 mL enthalten, bei 37 °C, 5 % CO₂ und 25 Umdrehungen/min für weitere drei Tage.
   13. Geben Sie weitere 100 ml ISF-1-Medium, ergänzt mit 1 % Penicillin/Streptomycin (vorgewärmt auf 37 °C), in jede der NLDC-145-haltigen Rollerflaschen und füllen Sie sie so bis zur 400-ml-Marke.
   14. Die Rollerflaschen, die nun jeweils 400 mL enthalten, werden weitere sieben Tage lang bei 37 °C, 5 % CO₂ und 25 Umdrehungen/min kultiviert.
       Anmerkung: Während dieser Woche wird die Kultur sehr dicht (bis zu 95 % Dichte) und die Lebensfähigkeit nimmt ab (auf bis zu 50 %), was eine maximale Antikörperfreisetzung ermöglicht.
2. Für die Aufreinigung von αDEC-205 aus dem Kulturüberstand wird die NLDC-145-Zellsuspension (aus beiden Walzenflaschen) direkt in autoklavierte 500-ml-Zentrifugationsflaschen gegossen.
   Anmerkung: Es sollte ein Gesamtvolumen von 800 ml Kultur entnommen werden.
   1. Zentrifugieren Sie die Kultur 30 Minuten lang bei 8.600 x g und 4 °C, um Zellen und Ablagerungen zu entfernen.
   2. Sammeln Sie die Überstände, entsorgen Sie die Pellets und sammeln Sie die Überstände in einer sterilen Reagenzflasche.
      Anmerkung: Die Aufreinigung von αDEC-205 kann sofort begonnen werden (Schritt 2.) oder der Überstand kann kurzfristig bei 4 °C gelagert werden.

2. Aufreinigung des αDEC-205-Antikörpers aus dem NLDC-145-Zellüberstand

HINWEIS: Aus dem NLDC-145-Zellüberstand wird αDEC-205 mit einer Protein-G-Sepharose-Säule (wiederverwendbar) aufgereinigt. Die Säulenabmessungen betragen 15 mm x 74 mm und pro Säule werden 5 mL Protein G Sepharose verpackt.

1. Für die Vorbereitung und das Waschen der Protein-G-Sepharose-Säule setzen Sie einen luftdichten Gummistopfen auf die obere Öffnung der Protein-G-Sepharose-Säule. Durchstechen Sie den Gummistopfen mit zwei sterilen Kanülen (20 G x 1 1/2", 0,90 x 40 mm).
   1. Verbinden Sie eine 10 mL Spritze mit einer der beiden Kanülen und einen flexiblen Silikonschlauch (ca. 100 cm lang, 2,5 - 3 mm Durchmesser) mit einem Schlauchverbinder mit der zweiten Kanüle.
      Anmerkung: Die Spritze/Gummistopfen-Konstruktion ist wiederverwendbar und sorgt für ein Vakuum, das zu einem kontinuierlichen Fluss des großen Volumens des Kulturüberstands zur Protein-G-Sepharosesäule führt. Ziehen Sie dazu den Kolben der Spritze leicht zurück, um in den folgenden Schritten einen kontinuierlichen Flüssigkeitsfluss zu gewährleisten.
   2. Waschen Sie die Säule mit 50 ml 0,1 M Eisessig (pH 2), um möglicherweise verbleibende Antikörper aus einer früheren Antikörperreinigung zu entfernen. Legen Sie das Ende des Silikonröhrchens in die mit 0,1 M mit Eisessig (pH 2) gefüllte Reagenzflasche. Infolge des induzierten Vakuums laufen tropfenweise 50 mL der 0,1 M Eisessigsäure (pH 2) durch die Protein-G-Sepharose-Säule.
      HINWEIS: 0,1 M Eisessig (pH 2) sollten in einer Reagenzflasche aufbewahrt oder frisch in ein Becherglas gefüllt werden.
   3. Waschen Sie die Säule mit 100-200 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Legen Sie das Ende des Silikonröhrchens in eine PBS-gefüllte Reagenzflasche oder einen Becher. Lassen Sie 100-200 mL PBS tropfenweise durch die G-Sepharose-Säule des Proteins laufen.
2. Für die Aufreinigung von Antikörpern aus dem Überstand NLDC-145 laden Sie 800 ml des Überstands NLDC-145 (aus Schritt 1.2.2.) auf die Säule. Stecken Sie das Ende des Silikonröhrchens in die mit Überstand gefüllte Reagenzflasche NLDC-145. Lassen Sie den Überstand von 800 mL NLDC-145 tropfenweise durch die Säule laufen.
   1. Waschen Sie die Säule mit 500 mL PBS. Legen Sie das Ende des Silikonröhrchens in eine PBS-gefüllte Reagenzflasche oder ein Becherglas. Lassen Sie 500 mL PBS tropfenweise durch die Säule laufen.
   2. Für die Elution verwenden Sie 20 1,5-ml-Röhrchen und pipettieren Sie 100 μl 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) in jedes 1,5-ml-Röhrchen. Entfernen Sie den Gummistopfen von der Säule und pipettieren Sie 1 ml 0,1 M Glycin (pH 3) in die obere Kammer der Protein-G-Sepharose-Säule, um den Antikörper aus der Säule zu eluieren. Sammeln Sie den Durchfluss direkt als Eluat in einem der vorbereiteten 1,5 mL Röhrchen.
   3. Wiederholen Sie den Elutionsschritt (2.2.2.) für alle 20 Röhrchen (1,5 mL).
   4. Bestimmung der optischen Dichte aller Elutionsfraktionen bei 280 nm (OD₂₈₀) mit einem Spektralphotometer, um die antikörperhaltigen Fraktionen zu identifizieren.
      Anmerkung: Verwenden Sie die erste Elutionsfraktion als Leerzeichen.
   5. Fassen Sie alle Fraktionen mit einem OD₂₈₀ größer als 0,5 (ca. 10 Brüche).
   6. Die mit 20 % Ethanol gefüllte Protein-G-Sepharose-Säule bei 4 °C lagern.
3. Dialysieren Sie die gepoolten Elutionen gegen 1000 mL PBS (in einem 2000 mL Becherglas) bei 4 °C über Nacht unter Verwendung von Dialyseschläuchen mit einem Molekulargewichts-Cut-off (MWCO) von 12 - 14 kDa.
   1. Schneiden Sie den Dialyseschlauch in 20 cm große Stücke. Kochen Sie den Dialyseschlauch in 500-800 ml 10 mM EDTA (pH 7,5) 30 Minuten lang in einem Becherglas mit einer Heizplatte, um Verunreinigungen zu entfernen. Entsorgen Sie die 10 mM EDTA-Lösung (pH 7,5) und kochen Sie den Dialyseschlauch 10 Min. lang in entionisiertem Wasser
      Anmerkung: Der Dialyseschlauch kann direkt verwendet oder in 0,01 % Natriumazid (NaN₃)/H₂O Lösung bei 4 °C bis zur nächsten Verwendung gelagert werden.
   2. Verschließen Sie den Boden des Dialyseschlauchs mit einem geeigneten Dialyseschlauchverschluss/einer einteiligen, klappbaren Klemme und pipettieren Sie die Antikörper-Elution vorsichtig in den Dialyseschlauch. Verschließen Sie die Oberseite des Dialyseschlauchs mit einer zweiten Klemme.
   3. Befestigen Sie die obere Klemme des Dialyseschlauchs an einem schwimmenden Ständer, setzen Sie sie zusammen mit einem Magnetrührstab in das PBS-gefüllte Becherglas ein und stellen Sie das Becherglas auf einen Magnetrührer.
   4. Über Nacht unter Rühren bei 4 °C dialysieren.
4. Um die Konzentration von αDEC-205 zu erhöhen, wird das gesamte Dialysat mit 10 kDa MWCO in einen Zentrifugalkonzentrator geladen. Öffnen Sie eine Klemme des Schlauches und pipettieren Sie vorsichtig das komplette Dialysat aus dem Dialyseschlauch in den Zentrifugalkonzentrator (10 kDa MWCO).
   Anmerkung: Berühren Sie den Boden des Konzentrators nicht mit der Pipettenspitze.
   1. 30 min bei 693 x g (2.000 U/min) und 4 °C zentrifugieren.
   2. Beladen Sie den Zentrifugalkonzentrator mit 10 mL PBS und zentrifugieren Sie ihn bei 693 x g (2.000 U/min) und 4 °C, bis das endgültige Volumen der Antikörperlösung 1-1,5 mL beträgt.
      Anmerkung: Erforderlichenfalls ist der Zentrifugationsschritt nach Nummer 2.4.1 zu wiederholen. , um die gewünschte Menge einzustellen.
   3. Mit einem Spektralphotometer ist die optische Dichte der konzentrierten αDEC-205-Lösung bei 280 nm (OD₂₈₀) zu bestimmen. Verwenden Sie PBS als Leerzeichen.
   4. Berechnen Sie die Konzentration von αDEC-205 mit der folgenden Formel:
      Konzentration [mg/ml] = OD₂₈₀/1,4.
   5. Filtrieren Sie die αDEC-205-Lösung mit einer 0,22-μm-Spritzenfiltereinheit.
      Anmerkung: Die Aufreinigung von αDEC-205 aus dem NLDC-145-Hybridom-Zellüberstand kann auch mittels FPLC (Fast Protein Liquid Chromatographie) erfolgen. Aufgereinigtes αDEC-205 kann für die Langzeitlagerung bei 4 °C oder bei -18 °C gelagert werden.

3. Chemische Konjugation von OVA an αDEC-205

HINWEIS: Für eine optimale chemische Konjugation ist ein Verhältnis von 0,5 mg OVA-Protein zu 2,5 mg αDEC-205 (1:5) erforderlich. Dieses Verhältnis kann jedoch für andere Proteine und Antikörper variieren und muss für alternative Konjugate optimiert werden. Die Reduktion der Disulfidbindungen des OVA-Proteins erfolgt durch Inkubation mit 30 mM TCEP-HCl, wodurch die Sulfhydrylgruppen für die chemische Konjugation αDEC-205 ausgesetzt werden und in Schritt 3.2 240 μl TCEP-HCl benötigt werden. Beide Schritte, die TCEP-induzierte Reduktion der OVA (Schritt 3.1.) und die Sulfo-SMCC-Aktivierung von αDEC-205 (Schritt 3.2.), sollten vorzugsweise parallel durchgeführt werden.

1. Bereiten Sie eine 125 mM TCEP-HCl-Lösung (pH 7,0) frisch vor. Wiegen Sie die gewünschte Menge TCEP-HCl ab und lösen Sie das TCEP-HCl in 0,9 M Tris-Base (pH 8,8) auf. Verwenden Sie pH-Indikatorstreifen, um den pH-Wert der 125 mM TCEP-HCl-Lösung (die neutral sein sollte) zu testen, und stellen Sie den pH-Wert mit Tris-Base (pH 8,8) ein.
   1. Pipettieren Sie 200 μl OVA-Proteinlösung (mit 0,5 mg OVA) in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen. 240 μl, 125 mM TCEP-HCl und 560 μl steriles Reinstwasser werden dem OVA-Protein mit einer Pipette bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mg/mL OVA-Protein und 30 mM TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl) zugegeben.
      HINWEIS: 2,5 mg EndoGrade OVA (lyophilisiert) werden in 1 ml PBS gelöst, was zu einer 2,5 mg/ml OVA-Lösung führt.
   2. Inkubieren Sie die resultierende OVA/TCEP-HCl bei Raumtemperatur für 1,5 h.
      Anmerkung: Verlängern Sie diesen Inkubationsschritt nicht.
2. Um αDEC-205 für die Konjugation zu aktivieren, lösen Sie 2 mg Sulfo-SMCC in 100 μl Reinstwasser.
   Anmerkung: Sulfo-SMCC ist anfällig für Hydrolyse. Daher sollten größere Mengen an ungelöstem Sulfo-SMCC schnell verarbeitet oder verfügbare 2 mg Aliquote verwendet werden.
   1. Verdünnen Sie αDEC-205 in PBS so, dass 2,5 mg in 900 μl enthalten sind.
   2. Mischen Sie 2,5 mg αDEC-205 (900 μl Volumen; erhalten aus Schritt 3.2.1) und 100 μl Sulfo-SMCC (aus Schritt 3.2.) in ein 1,5 ml-Röhrchen, was ein Gesamtvolumen von 1 ml ergibt.
   3. Die αDEC-205/Sulfo-SMCC-Lösung wird 30 Minuten lang bei 37 °C und 550 U/min in einem Heizblock inkubiert.
3. Nach diesen Inkubationen werden überschüssige Sulfo-SMCC und TCEP-HCl sofort mit Hilfe von Entsalzungssäulen (MWCO 7 kDa; 5 mL Säulenvolumen) aus den Lösungen entfernt.
   1. Drehen Sie den unteren Verschluss der Säule (MWCO 7 kDa) ab, lösen Sie die Kappe und legen Sie die Säule in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
   2. 2 min bei 1.000 x g bei Raumtemperatur zentrifugieren, um die Flüssigkeit zu entfernen.
   3. Legen Sie die Säule in eine frische Tube und entfernen Sie die Kappe. Laden Sie den Antikörper/Sulfo-SMCC bzw. die OVA/TCEP-HCl langsam in die Mitte des kompakten Harzbetts mit jeweils einer Säule.
   4. 2 min bei 1.000 x g bei Raumtemperatur zentrifugieren.
   5. Entsorgen Sie die Säulen nach Gebrauch. Die Lösungen, die Antikörper und OVA enthalten, die für die Konjugation vorbereitet sind, befinden sich in den Röhrchen.
   6. Mischen Sie beide Lösungen sofort durch Pipettieren zur Konjugation von αDEC-205 und OVA.
   7. Das resultierende αDEC-205- und OVA-Gemisch wird über Nacht bei 4 °C inkubiert.
4. Nach der Konjugation wird überschüssige, ungebundene OVA aus der Lösung entfernt und die gekoppelte αDEC-205/OVA wird mit einem zentrifugalen Proteinkonzentrator (MWCO 150 kDa) konzentriert.
   1. Spülen Sie den zentrifugalen Proteinkonzentrator (MWCO 150 kDa) vor, indem Sie 12 mL PBS auf die Säule pipettieren und 2 Minuten lang bei 2.000 x g bei Raumtemperatur zentrifugieren.
      Anmerkung: Erforderlichenfalls wird der Zentrifugationsschritt (3.4.1.) wiederholt, bis ein Volumen von etwa 5 mL die Säule durchlaufen hat.
   2. Bevor Sie die αDEC-205/OVA in den zentrifugalen Proteinkonzentrator laden, bewahren Sie eine 20-μl-Probe der unkonzentrierten αDEC-205/OVA für die Western-Blot-Analyse auf. Dieses Aliquot bis zur Analyse bei 4 °C lagern.
   3. Laden Sie die αDEC-205/OVA durch Pipettieren auf den zentrifugalen Proteinkonzentrator.
      Anmerkung: Vermeiden Sie jeglichen Kontakt mit dem Bett der oberen Kammer des Zentrifugalkonzentrators.
   4. Füllen Sie den Konzentrator auf 15 mL mit PBS und zentrifugieren Sie den Konzentrator 5 min lang bei 2.000 x g bei Raumtemperatur.
   5. Bewahren Sie eine Probe des Durchflusses (Durchfluss I) für die Western-Blot-Analyse auf und verwerfen Sie den verbleibenden Durchfluss.
   6. Füllen Sie den Konzentrator auf 10 mL mit PBS und zentrifugieren Sie den Konzentrator für mindestens 8 min bei 2.000 x g bei Raumtemperatur.
   7. Bewahren Sie eine Probe für den zweiten Durchfluss (Durchfluss II) für die Western-Blot-Analyse auf und verwerfen Sie den verbleibenden Durchfluss.
   8. Sobald die gewünschte Anreicherung erreicht ist (ca. 1,5 ml der αDEC-205/OVA-Lösung sollten in der oberen Kammer verbleiben), wird die konzentrierte Probe vorsichtig aspiriert.
      Anmerkung: Wenn zu viel Flüssigkeit in der oberen Kammer verbleibt, kann die Zentrifugation wiederholt werden, sollte aber so kurz wie möglich gehalten werden.
5. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration der resultierenden αDEC-205/OVA mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer. Verwenden Sie PBS als Leerzeichen.
6. Filtrieren Sie die αDEC-205/OVA mit einer 0,22-μm-Spritzenfiltereinheit.
   Anmerkung: Für spätere Analysen und In-vivo-Experimente kann αDEC-205/OVA bei 4 °C oder -18 °C gelagert werden.

4. Überprüfung der chemischen Konjugation durch ELISA

1. Durchführung eines ELISA zur weiteren Überprüfung der erfolgreichen chemischen Konjugation, die zu αDEC-205/OVA führt.
2. Eine geeignete 96-Well-ELISA-Platte wird mit 100 μl/Well 3 ng/μl Kaninchen-αOVA-Antikörper in Beschichtungspuffer (0,1 M Natriumbicarbonat (NaHCO₃), pH 9,6, verdünnt in H₂O) beschichtet.
   1. Die Platte über Nacht bei 4 °C inkubieren.
3. Nach dem Beschichten waschen Sie die Platte dreimal mit PBS, z. B. mit einem ELISA-Wascher.
4. Blockieren Sie die Platte, indem Sie 200 μl Blockierungspuffer (10 % FCS in PBS) in jede Vertiefung der Platte pipettieren und die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.
5. αDEC-205/OVA (aus Schritt 3.6) wird seriell 1:2 in Blockierungspuffer (10 % FCS in PBS) verdünnt, um Verdünnungen von 6 μg/ml bis hinunter zu 93,8 ng/ml αDEC-205/OVA zu erhalten, und 100 μl/Vertiefung dieser abnehmenden Mengen an αDEC-205/OVA in die Vertiefungen gegeben.
   1. Inkubieren Sie die Platte 1 h lang bei Raumtemperatur.
6. Waschen Sie die Platte dreimal mit PBS, z. B. mit einer ELISA-Waschmaschine.
7. Geben Sie 100 μl des Ziegen-αrat-IgG+IgM(H+L)-HRPO-Antikörpers (verdünnt auf 1:2.000 in Blockierungspuffer (10 % FCS in PBS)) in jede Vertiefung der Platte.
   1. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
8. Waschen Sie die Platte dreimal mit PBS, z.B. mit einer ELISA-Waschmaschine.
9. Geben Sie 50 μL HRPO-Substrat in die Vertiefungen. Wenn Sie eine klare Farbreaktion beobachten, stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 150 μl Stopplösung (1M H₂SO₄) pro Well.
10. Nach 5 Minuten lesen Sie die Absorption bei 450 nm mit einem ELISA-Reader.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Blocking-Puffer (ELISA)			10 % FBS in PBS
Zellkulturflasche T25	Greiner Bio-One	690175	Wir verwenden Standard-CELLSTAR-Zellkulturflaschen mit Filterkappen, alternativ Suspensionskulturkolben (690195 )
Zellkulturflasche T75	Greiner Bio-One	658175	Wir verwenden Standard-CELLSTAR-Zellkulturflaschen mit Filterkappen, alternativ Suspensionskulturkolben (658195)
Zellkulturflasche T175	Greiner Bio-One	661175	Wir verwenden Standard-CELLSTAR-Zellkulturflaschen mit Filterkappen, alternativ Suspensionskulturkolben (661195)
Zentrifugalkonzentrator MWCO 10 kDa	Schneidermuskel	VS2001	Zentrifugalkonzentrator Vivaspin 20
Zentrifugal-Proteinkonzentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 88532	Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; wir verwenden den Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (Katalognummer 89921), der jedoch nicht mehr lieferbar ist
Zentrifugen-Flaschen	Nalgene	Tel.: 525-2314	PPCO (Polypropylen-Copolymer) mit PP (Polypropylen) Schraubverschluss, 500 ml; bezogen von VWR, Deutschland
Beschichtungspuffer (ELISA)			0,1 M Natriumbicarbonat (NaHCO3) in H2O (pH 9,6)
Entsalzungskolonnen MWCO 7 kDa	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 89891	Thermo Scientific Zeba Spin-Entsalzungssäulen, 7 K MWCO, 5 mL
Detektionsreagenz ELISA (HRPO-Substrat)	Sigma-Aldrich/Merck	T8665-100ML	3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) flüssiges Substratsystem
ELISA 96-Well-Platte	Thermo Fisher Scientific	442404	MaxiSorp Nunc-Immuno Platte
Fötales Kälberserum	PAN-BIOtech	Tel. P40-47500	FBS Gute Stärke
ISF-1 mittel	Biochrom/bioswisstec	Nr. F 9061-01
NLDC-145-Hybridom	ATCC	HB-290	wenn noch nicht vorhanden, können die Hybridomzellen von ATCC erworben werden
Eieralbumin	Hyglos (über BioVendor)	Artikel-Nr.: 321000	EndoGrade OVA ultrapure mit <0,1 EU/mg
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternativ kann Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) verwendet werden
PETG-Polyethylenterephthalat-Glykol-Zellkultur-Rollflaschen	Nunc In Vitro	Tel.: 734-2394	Standard PDL-beschichtet, belüftet (1.2X), 1050 cm², 100 - 500 ml Volumen; bezogen von VWR, Deutschland
pH-Indikator-Streifen	Merck	109535	pH-Indikator-Streifen 0-14
Polyklonaler αrat-IgG+IgM-HRPO-Antikörper (ELISA)	Jackson Immunforschung	Artikel-Nr.: 112-035-068	bezogen von Dianova, Deutschland; verwendet im Verhältnis 1:2000 für ELISA
Polyklonale Kaninchen-αOVA (ELISA)	Abcam (Englisch	AB181688	Verwendet bei 3 ng/μl
Protein G Sepharose-Säule	Merck/Millipore	Nr. P3296	5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow werden auf eine leere Säule PD-10 (Merck, GE 17-0435-01) verpackt
Gummistopfen	Omnilab (Englisch)	5230217	DEUTSCH & NEUMANN Gummistopfen (unterer Φ 17 mm; oberer Φ 22 mm)
Silikon-Schlauch	Omnilab (Englisch)	5430925	DEUTSCH & NEUMANN (innen Φ 1 mm; außen Φ 3 mm)
Schlank-Schnell			Wir haben normale Slim-Fast Schokolade verwendet, die in der Apotheke frei erhältlich ist, da sie bei diesem Western-Blot-Ansatz bessere Ergebnisse lieferte als Milchpulver
Stopp-Lösung (ELISA)			1M H2SO4
Sulfo-SMCC	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 22322	Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternativ Katalognummer A39268 (10 x 2 mg)
Spritzenvorsatz-Filtereinheit 0,22 μm	Merck/Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Spritzenvorsatz-Filtereinheit, 0,22 μm, PVDF, 33 mm, gammasterilisiert
Spritze 10 ml	Omnilab (Englisch)		Einmalspritzen Injekt® Solo B.Braun
Sterican® Kanülen	B. Braun		Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0,90 x 40 mm; gelb
TCEP-HCl	Thermo Fisher Scientific	Nr. A35349
Schlauch-Verbinder	Omnilab (Englisch)		Kleinfeld Miniatur-Schlauchverbinder für Silikonschlauch