Comet Assay zur Detektion von DNA-Schäden in Zellen

Zusammenfassung

Quelle: Ji, Y., et al. Ein Hochdurchsatz-Comet-Assay-Ansatz zur Beurteilung zellulärer DNA-Schäden. J. Vis. Exp. (2022).

Das Video zeigt den Kometen-Assay zum Nachweis von DNA-Schäden nach Exposition gegenüber schädlichen Stoffen. Unter alkalischen Bedingungen wickelt sich die DNA ab und denaturiert, und bei der Elektrophorese wandern die unbeschädigte und die beschädigte DNA unterschiedlich im Agarosegel und bilden eine kometenförmige Struktur. Die langsam wandernde unbeschädigte DNA bildet den kreisförmigen Kometenkopf, während die schnell wandernden beschädigten DNA-Fragmente den länglichen Kometenschweif bilden.

Protokoll

1. Vorbereitung der Materialien für den Comet-Assay

1. Vorbereitung der Objektträger
   1. Gießen Sie 1 % (w/v) Agarose mit normalem Schmelzpunkt [gelöst in doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O)] in ein 50-ml-Röhrchen und Mikrowelle, um die Agarose in der ddH₂O aufzulösen. Bei 37 °C lagern, um eine Verfestigung vor dem Beschichten von Objektträgern zu verhindern. Sollte es zu einer Verfestigung kommen, entsorgen und frisch zubereiten.
   2. Mikroskop-Objektträger werden vorbeschichtet, indem die Objektträger in das 50-ml-Röhrchen getaucht werden, das 1 % (w/v) Agarose mit normalem Schmelzpunkt enthält.
   3. Wischen Sie di....

Ergebnisse

Abbildung 1: Repräsentative Bilder eines Kometen-Assay-Objektträgers und eines HTP-Racks (Objektträger). (A) Zur korrekten Ausrichtung ist die vorbeschichtete Fläche des Objektträgers an einem schwarzen Punkt in der rechten Ecke eines Objektträgers zu erkennen. (B) Das Bild des HTP-Racks zeigt, wie die Objektträger in einer engen vertikalen Ausrichtung gehalten werden, mit Laschen am Träger, um ih.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
22 x 22 mm Glas-Deckgläser	Fisher Scientific, Hampton, NH, USA	Tel.: 631-0124
Fluoreszenzmikroskop bestückt mit einer Kamera	Zeiss, Jena, Deutschland
HTP Comet Assay-System	Hackbeil Wissenschaftlich	COMPAC- 50
Humane Keratinozyten (HaCaTs)	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA	unterbrochen	Kann von einem anderen erworben werden Unternehmen ADDEXBIO TECHNOLOGIES Kat# T0020001
Wasserstoffperoxid (H2O2) 30% in Wasser	Fisher Scientific, Hampton, NH, USA	Nr. BP2633-500
Bild- und Datenanalyse-Software	Wahrnehmungsinstrument, Bury St Edmunds, England, Vereinigtes Königreich	125525	Kostenlose Bildanalyse-Software is verfügbar z.B. ImageJ
Niedriger Schmelzpunkt Agarose	Invitrogen Waltham, MA, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. P4864
Na2 EDTA (Dinatrium Ethylendiamintetraessigsäure)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	Nr. E5134
NaCl (Natriumchlorid)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	Nr. S7653
Nanopure Infinity Ultrapure Wasser System (Barnstead Nanopure)	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	Nr. D11901	Reinstwasser (16 MΩ cm^{-1} )
NaOH (Natriumhydroxid)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. E5134
Normaler Schmelzpunkt Agarose	Fisher Scientific, Hampton, NH, Vereinigte Staaten von Amerika	16520100	Für die Vorbeschichtung von Objektträgern
Propidium Iodide (1,0 mg/ml in Wasser)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	Artikel-Nr.: 12-541BP486410ML
Mikroskop aus einfachem Milchglas Diapositive	Fisher Scientific, Hampton, NH, Vereinigte Staaten von Amerika	12-541B
Schiebekasten	Fisher Scientific, Hampton, NH, Vereinigte Staaten von Amerika	Tel.: 03-448-2	Lichtdicht, zum Schutz der Zellen vor Die Entstehung zufälliger Schaden (nach der weit verbreiteten Ansicht) und verhindern ein Ausbleichen der Leuchtstoff färben
Slide Kühlplatte	Hackbeil Wissenschaftlich, Rugby, England, Vereinigtes Königreich	CSL-CHILLPLATE
Behandlungsschale	Hackbeil Wissenschaftlich, Rugby, England, Vereinigtes Königreich	STAINDISH4X
Tris-Basis	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	Artikel-Nr.: 93362
Triton X-100	Fisher Scientific, Hampton, NH, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. BP151-500
Trypsin EDTA (0,5%)	Invitrogen Gibco, Waltham, MA, Vereinigte Staaten von Amerika	15400054
Vertikaler Schlittenträger	Hackbeil Wissenschaftlich, Rugby, England, Vereinigtes Königreich	COMPAC-25