Comet Assay zur Detektion von DNA-Schäden in Zellen

Zusammenfassung

Quelle: Ji, Y., et al. Ein Hochdurchsatz-Comet-Assay-Ansatz zur Beurteilung zellulärer DNA-Schäden. J. Vis. Exp. (2022).

Das Video zeigt den Kometen-Assay zum Nachweis von DNA-Schäden nach Exposition gegenüber schädlichen Stoffen. Unter alkalischen Bedingungen wickelt sich die DNA ab und denaturiert, und bei der Elektrophorese wandern die unbeschädigte und die beschädigte DNA unterschiedlich im Agarosegel und bilden eine kometenförmige Struktur. Die langsam wandernde unbeschädigte DNA bildet den kreisförmigen Kometenkopf, während die schnell wandernden beschädigten DNA-Fragmente den länglichen Kometenschweif bilden.

Protokoll

1. Vorbereitung der Materialien für den Comet-Assay

1. Vorbereitung der Objektträger
   1. Gießen Sie 1 % (w/v) Agarose mit normalem Schmelzpunkt [gelöst in doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O)] in ein 50-ml-Röhrchen und Mikrowelle, um die Agarose in der ddH₂O aufzulösen. Bei 37 °C lagern, um eine Verfestigung vor dem Beschichten von Objektträgern zu verhindern. Sollte es zu einer Verfestigung kommen, entsorgen und frisch zubereiten.
   2. Mikroskop-Objektträger werden vorbeschichtet, indem die Objektträger in das 50-ml-Röhrchen getaucht werden, das 1 % (w/v) Agarose mit normalem Schmelzpunkt enthält.
   3. Wischen Sie die Rückseite der Objektträger nach dem Eintauchen der Objektträger schnell ab.
      Anmerkung: Wenn die Rückseite der Objektträger nicht richtig abgewischt wird, erhöht sich das Hintergrundrauschen der Objektträger während der Analyse Schritt für das Mikroskop.
   4. Beschriften Sie den beschichteten Objektträger mit einem Permanentmarker in der unteren rechten Ecke des mattierten Abschnitts (Abbildung 1A). Hier wird angezeigt, welche Seite der Folie vorbeschichtet ist.
   5. Lassen Sie die Agarose fest werden und trocknen Sie über Nacht bei Raumtemperatur.
   6. Wickeln Sie die getrockneten Objektträger in Seidenpapier ein und bewahren Sie sie in einer Schachtel auf.

2. Vorbereitung der Proben

1. Kultivierte Zellen
   Anmerkung: Behandeln Sie zunächst die Zellen mit dem/den schädigenden Wirkstoff(en), bevor Sie mit dem Comet-Assay beginnen. Führen Sie dann die folgenden Schritte aus.
   1. Wenn die Zellen adhärent sind, trypsinisieren die Zellen, um sie aus dem Zellkulturkolben oder der Zellkultur-Petrischalen bei der entsprechenden Konfluenz der Zellen freizusetzen. Neutralisieren Sie Trypsin durch Zugabe von serumhaltigen Medien.
   2. Übertragen Sie die Zellen in ein 50-ml-Röhrchen, zentrifugieren Sie sie (z. B. für HaCaTs zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 300 x g), entfernen Sie vorsichtig den Überstand und fügen Sie 1 mL PBS zum Zellpellet hinzu.
   3. Führen Sie eine Zellzählung durch.
   4. 30.000 Zellen in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und 5 Minuten lang bei 4 °C bei 7.607 x g zentrifugieren.
   5. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und lagern Sie das Zellpellet im Dunkeln auf Eis, bevor Sie den Kometen-Assay durchführen.
      Anmerkung: Die Zellen sollten regelmäßig auf Mykoplasmen-Kontamination getestet werden, bevor der Kometen-Assay durchgeführt wird, um unter anderem die Bildung von artefaktischen DNA-Schäden und eine veränderte DNA-Schadensreaktion zu verhindern, wie berichtet. Die Zentrifugationsbedingungen können je nach verwendetem Zelltyp je nach verwendetem Zelltyp geändert werden.
2. Vorbereitung von kultivierten Zellen für den Reparaturassay
   1. Kultivieren Sie Zellen in der Zellkulturflasche oder Petrischale.
   2. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 ml PBS, bevor Sie die Zellen mit schädigenden Mitteln behandeln (z. B. bei BE-M17-Zellen 20 Minuten lang mit 50 μM H₂O₂ auf Eis behandeln), um zu verhindern, dass die Reparatur während der Behandlung auftritt.
   3. Waschen Sie die Zellen zweimal vorsichtig mit 1 ml PBS, um alle verbleibenden schädlichen Stoffe zu entfernen.
   4. Führen Sie das Zellkulturmedium wieder ein und lassen Sie die Zellen für unterschiedliche Zeiträume (z. B. 0 min, 30 min, 2 h, 6 h, 24 h und 30 h) in einem befeuchteten Inkubator (37 °C, 5 % CO₂) reparieren.
   5. Zu jedem Zeitpunkt werden 30.000 Zellen in 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO)-haltigem Zellkulturmedium entnommen und bei -80 °C gelagert.
   6. Bevor Sie den Kometen-Assay durchführen, tauen Sie die Zellen schnell bei 37 °C in einem Wasserbad auf und zentrifugieren Sie sie bei 7.607 x g für 5 min bei 4 °C.
   7. Entfernen Sie den Überstand und lagern Sie das Zellpellet auf Eis, bevor Sie den Assay durchführen (d. h. ab Schritt 3).

3. Zelllyse

HINWEIS: Führen Sie alle Eingriffe auf Eis durch.

1. Verwenden Sie 12.000 Zellen oder 2,5 μl Vollblut pro Gel.
2. Bereiten Sie 0,6 % (w/v) in PBS gelöste Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in der Mikrowelle vor und legen Sie sie in ein Wasserbad bei 37 °C, um ein Festigen zu verhindern.
3. Beschriften Sie das mattierte Ende der vorbeschichteten Objektträger mit dem Namen des Prüfarztes, dem Datum und den Behandlungsinformationen mit einem Permanentmarker oder Bleistift.
4. Stellen Sie eine Kühlplatte auf eine flache Bank und legen Sie die beiden gefrorenen Kühlakkus in die Schiebeschublade unter der Metalloberfläche ein (wie in Abbildung 2 gezeigt).
5. Legen Sie die Objektträger auf die Kühlplatte und lassen Sie die Objektträger 1-2 Minuten vorkühlen, bevor Sie die 0,6 % (w/v) Agarose-haltigen Zellen mit niedrigem Schmelzpunkt hinzufügen.
   Anmerkung: Wenn Sie die Objektträger länger als 1-2 Minuten auf der Kühlplatte belassen, kann sich aufgrund der Umgebungsfeuchtigkeit Kondenswasser auf der Objektträgeroberfläche bilden. Dies kann dazu führen, dass die Agarosegele mit niedrigem Schmelzpunkt auf den Objektträgern weniger stabil sind.
6. Das Pellet (Schritt 2.2.7) durch Vortexen dispergieren. Stellen Sie sicher, dass der gesamte Überstand aus dem Pellet entfernt wurde. Stellen Sie die Probenröhrchen (mit den pelletierten Zellen) sofort wieder auf Eis.
   Anmerkung: Wenn Sie die probenhaltigen Röhrchen in die Zentrifuge legen, legen Sie sie mit dem Scharnier nach außen, so dass das Pellet auf dieser Seite des Röhrchens aufgefangen wird. Manchmal ist es schwierig, das Pellet zu sehen, und es ist leicht, es zu lösen, wenn der Überstand entfernt wird. Das Zentrifugieren mit dem Röhrchendeckel in dieser Ausrichtung ermöglicht es zu wissen, wo sich das Zellpellet befinden wird.
7. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 200 μl 0,6 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (LMP-Agarose) und mischen Sie es durch Auf- und Abpipettieren, ohne Blasen zu bilden. Übertragen Sie anschließend schnell 80 μl LMP-Agarose-haltige Zellen auf einen gekühlten Objektträger und legen Sie schnell ein Deckglas auf das Gel.
8. Lassen Sie das Gel 1-2 min auf der Kühlplatte aushärten.
9. Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine 500-ml-Arbeitslösung aus Lysepuffer vor (Tabelle 1) und gießen Sie sie in die Lyseschale (Abbildung 3).
10. Sobald die Gele ausgehärtet sind, entfernen Sie die Deckgläser schnell, indem Sie den Gleiter vorsichtig zwischen Daumen und Zeigefinger halten und das Deckglas vom Gel schieben.
11. Legen Sie die Objektträger mit den Proben in den Objektträgerträger (alle schwarzen "Punkt"-Markierungen auf Objektträgern sollten in die gleiche Richtung zeigen, wenn sie in einen Träger gelegt werden) (Abbildung 1B) und platzieren Sie dann den Objektträgerträger in der Lyseschale (Abbildung 3).
12. Schließen Sie den Deckel der Analyseschale und bewahren Sie die Analyseschale über Nacht bei 4 °C oder 30 Minuten bei Raumtemperatur im Kühlschrank auf, je nachdem, was am besten in den Zeitplan des Bedieners passt.

4. Elektrophorese

1. Nehmen Sie den Objektträgerträger vorsichtig aus der Lyseschale. Achten Sie darauf, die Gele nicht zu stören.
2. Legen Sie den Objektträgerträger vorsichtig in eine mit eiskaltem ddH₂O vorbefüllte Spülschüssel und lassen Sie ihn 30 Minuten einwirken, wobei Sie darauf achten, dass die Objektträger vollständig mit ddH₂O bedeckt sind.
3. Legen Sie ein gefrorenes Kühlpaket in die Schiebeschublade unter dem Elektrophoresetank ein, um die optimale Puffertemperatur aufrechtzuerhalten.
4. Geben Sie vorsichtig eiskalte Elektrophorese-Arbeitslösung (Tabelle 1) in den Elektrophoresebehälter und überführen Sie den Objektträger in den Elektrophoresebehälter. Richten Sie die Objektträger so aus, dass ihre durchsichtigen Teile mit den zellhaltigen Gelen (d. h. NICHT die mattierten/markierten Enden) zur Kathode (rote Elektrode) zeigen.
5. Lassen Sie die Objektträger 20 Minuten lang im Elektrophoresetank ruhen, damit sich die DNA entspannt und entspannt. Lassen Sie die Stromversorgung während dieses Schritts ausgeschaltet.
6. Setzen Sie bei Bedarf ein neues gefrorenes Kühlpaket ein, um die Kühlung zu maximieren.
7. Führen Sie die Elektrophorese für 20 min bei 1,19 V/cm oder den optimierten Bedingungen durch.
   Anmerkung: Die Optimierung der Elektrophorese-Betriebsbedingungen und des Puffervolumens wird für jedes Labor empfohlen. Die Verwendung von nur einem einzigen Objektträgerträger während der Elektrophorese verursacht keinen Einfluss der Objektträger auf den Widerstand des Elektrophoresepuffers, und die Autoren sahen keinen signifikanten Effekt auf die Spannung oder den Strom, wenn sich die Anzahl der Objektträger änderte.
8. Schalten Sie die Stromversorgung aus, nehmen Sie den Objektträgerträger vorsichtig aus dem Elektrophoresebehälter und lassen Sie ihn 30 s lang auf Seidenpapier abtropfen.
9. Setzen Sie den Objektträgerträger in die Schale mit dem Neutralisationspuffer ein (Tabelle 1). 20 Minuten ziehen lassen.
10. Nehmen Sie den Objektträger aus der Neutralisationsschale, legen Sie ihn in die Spülschüssel mit eiskaltem ddH2O und lassen Sie ihn 20 Minuten einwirken.
11. Nehmen Sie den Objektträgerträger aus dem Wasser und lassen Sie die Objektträger in einem Inkubator bei 37 °C für 1 h oder über Nacht bei Raumtemperatur trocknen oder trocknen Sie nicht, je nach Zeitplan des Bedieners.
    Anmerkung: Wenn in Schritt 4.11 keine Trocknung erfolgt, führen Sie den Färbeschritt aus 5.2 durch.

5. Färbung von Propidiumiodid (PI)

1. Den Objektträgerträger in eine Spülschüssel mit eiskaltem ddH₂O geben, um die Objektträger zu rehydrieren, und 30 Minuten ruhen lassen.
2. Legen Sie den Objektträgerträger in eine Färbeschale mit 2,5 μg/ml Propidiumiodidlösung.
   Anmerkung: Propidiumiodid ist lichtempfindlich, also handhaben Sie es in einem abgedunkelten Bereich. Es ist auch giftig.
3. Schließen Sie den Deckel der Färbeschale und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur.
4. Den Objektträger in eine separate Schüssel umfüllen und mit eiskaltem ddH₂O 20 Min. waschen.
5. Nehmen Sie den Objektträger aus der Schale und trocknen Sie ihn vollständig im Dunkeln, entweder in einem 37 °C heißen Inkubator oder bei Raumtemperatur, je nach Zeitplan oder Vorliebe des Bedieners.
6. Sobald die Objektträger vollständig getrocknet sind, nehmen Sie sie aus dem Objektträgerträger und bewahren Sie sie in einer Objektträgerbox im Dunkeln auf, bis sie für die Bildanalyse bereit sind.
   Anmerkung: Die Dias bleiben auf unbestimmte Zeit lesbar und können bei Bedarf neu gefärbt werden.

6. Comet-Bewertung und Datenanalyse

HINWEIS: Der Begriff "Komet" leitet sich von den Bildern beschädigter Zellen ab, die nach der Durchführung des Assays unter einem Mikroskop betrachtet werden (Abbildung 4). Unter Elektrophoresebedingungen wandert die DNA in den unbeschädigten Zellen weitgehend nicht, sondern verbleibt in einem Sphäroid, der als Kometen-"Kopf" bezeichnet wird. Das Vorhandensein von Strangbrüchen ermöglicht es der Zelle jedoch, aus dem Kopf zu wandern und einen "Schweif" zu bilden, was zu einem Aussehen wie ein Komet führt (Abbildung 4). Je mehr DNA sich im Schwanz befindet, desto mehr Schäden sind vorhanden.

1. Schalten Sie das Fluoreszenzmikroskop mit dem PI-Filter (rot) (λ = 536/617 nm) und der Comet-Assay-Scoring-Software ein.
2. Geben Sie einen Tropfen Wasser mit einer Pasteur-Pipette in das Gel und bedecken Sie es mit einem Deckglas.
3. Legen Sie die Objektträger in das Fluoreszenzmikroskop und "ritzen" Sie die Kometen.
   Anmerkung: Die Bewertung ist ein Mittel, mit dem die Kometen bewertet werden, um das Ausmaß des Schadens zu bestimmen, der in jedem Kometen vorhanden ist. Im Großen und Ganzen kann dies durch die Verwendung von zwei Ansätzen erreicht werden, je nach der gewählten Präferenz des Benutzers, entweder mit dem Auge (Messung der Größe der Kometen auf einer Skala von null bis vier) oder durch die Verwendung von frei oder kommerziell erhältlicher Software30. Im Allgemeinen beurteilen beide Ansätze die Größe des Kometenschweifs, obwohl eine Vielzahl von Kometen-bezogenen Endpunkten bestimmt werden können. Wenn Sie die Software verwenden, klicken Sie auf die Mitte des Kometenkopfes und warten Sie, bis die Software den Kometen automatisch erkennt und dann den ausgewählten Endpunkt bewertet (Abbildung 4).
4. Bewerten Sie 50 Kometen pro Gel und 100 Kometen pro Probe (d. h. jede Probe entspricht verschiedenen DNA-schädigenden Behandlungen oder deren Replikaten).
5. Replizieren Sie die Experimente (n = 2) oder verdreifachen Sie die Experimente (n = 3).
   Anmerkung: Wenn nur n=2 Replikationsexperimente durchgeführt werden, kann keine statistische Analyse durchgeführt werden, aber wenn n=3 ist, ist der D'agostino-Normalitätstest durchzuführen. Die meisten Kometen-Assay-Daten bestehen keinen Normalitätstest. Verwenden Sie in diesem Fall einen nichtparametrischen Test (Kruskal-Wallis-Test mit dem Dunn-Mehrfachvergleichstest und Mann-Whitney-Tests mit Signifikanz bei p < 0,05).

Reagenz	Stammlösung	Funktionierende Lösung
Lyse-Puffer	100 mM Na2EDTA, 2,5 M NaCl und 10 mM Tris Base in ddH2O; pH-Wert auf 10 mit 10 M NaOH einstellen	1% Triton X-100 in Lyse-Stammlösung
Elektrophorese-Puffer	10 M NaOH und 200 mM Na2EDTA in ddH2O	300 mM NaOH und 1 mM Na2EDTA; pH-Wert > 13
Neutralisations-Puffer	0,4 M Tris Base in ddH2O; pH-Wert auf 7,5 mit HCl einstellen
Puffer zum Färbemittel	1 mg/ml Propidiumiodid	2,5 μg/mL Propidiumiodid in ddH2O

Tabelle 1: Zusammensetzung der Reagenzien, die im Hochdurchsatz-Alkalischen Kometen-Assay (HTP ACA) verwendet werden. Die Stamm- und Arbeitskonzentrationen von Lyse-, Elektrophorese-, Neutralisations- und Färbepuffern sind dargestellt.

Ergebnisse

Abbildung 1: Repräsentative Bilder eines Kometen-Assay-Objektträgers und eines HTP-Racks (Objektträger). (A) Zur korrekten Ausrichtung ist die vorbeschichtete Fläche des Objektträgers an einem schwarzen Punkt in der rechten Ecke eines Objektträgers zu erkennen. (B) Das Bild des HTP-Racks zeigt, wie die Objektträger in einer engen vertikalen Ausrichtung gehalten werden, mit Laschen am Träger, um ih...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
22 x 22 mm Glas-Deckgläser	Fisher Scientific, Hampton, NH, USA	Tel.: 631-0124
Fluoreszenzmikroskop bestückt mit einer Kamera	Zeiss, Jena, Deutschland
HTP Comet Assay-System	Hackbeil Wissenschaftlich	COMPAC- 50
Humane Keratinozyten (HaCaTs)	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA	unterbrochen	Kann von einem anderen erworben werden Unternehmen ADDEXBIO TECHNOLOGIES Kat# T0020001
Wasserstoffperoxid (H2O2) 30% in Wasser	Fisher Scientific, Hampton, NH, USA	Nr. BP2633-500
Bild- und Datenanalyse-Software	Wahrnehmungsinstrument, Bury St Edmunds, England, Vereinigtes Königreich	125525	Kostenlose Bildanalyse-Software is verfügbar z.B. ImageJ
Niedriger Schmelzpunkt Agarose	Invitrogen Waltham, MA, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. P4864
Na2 EDTA (Dinatrium Ethylendiamintetraessigsäure)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	Nr. E5134
NaCl (Natriumchlorid)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	Nr. S7653
Nanopure Infinity Ultrapure Wasser System (Barnstead Nanopure)	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	Nr. D11901	Reinstwasser (16 MΩ cm^{-1} )
NaOH (Natriumhydroxid)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. E5134
Normaler Schmelzpunkt Agarose	Fisher Scientific, Hampton, NH, Vereinigte Staaten von Amerika	16520100	Für die Vorbeschichtung von Objektträgern
Propidium Iodide (1,0 mg/ml in Wasser)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	Artikel-Nr.: 12-541BP486410ML
Mikroskop aus einfachem Milchglas Diapositive	Fisher Scientific, Hampton, NH, Vereinigte Staaten von Amerika	12-541B
Schiebekasten	Fisher Scientific, Hampton, NH, Vereinigte Staaten von Amerika	Tel.: 03-448-2	Lichtdicht, zum Schutz der Zellen vor Die Entstehung zufälliger Schaden (nach der weit verbreiteten Ansicht) und verhindern ein Ausbleichen der Leuchtstoff färben
Slide Kühlplatte	Hackbeil Wissenschaftlich, Rugby, England, Vereinigtes Königreich	CSL-CHILLPLATE
Behandlungsschale	Hackbeil Wissenschaftlich, Rugby, England, Vereinigtes Königreich	STAINDISH4X
Tris-Basis	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	Artikel-Nr.: 93362
Triton X-100	Fisher Scientific, Hampton, NH, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. BP151-500
Trypsin EDTA (0,5%)	Invitrogen Gibco, Waltham, MA, Vereinigte Staaten von Amerika	15400054
Vertikaler Schlittenträger	Hackbeil Wissenschaftlich, Rugby, England, Vereinigtes Königreich	COMPAC-25