Die Verwendung von radioaktivem Material (RAM) erfordert die vorherige Genehmigung durch ein bestimmtes Sicherheitskomitee an jeder Institution.
1. Aufnahme von Aminosäuren in Zellen
- Platte: 5 x 10:4 ST2-Zellen in jeder Vertiefung einer 12-Well-Gewebekulturplatte. Plattenzellen in α-MEM, die 10 % FBS, 100 μg/ml Penicillin und 0,1 μg/ml Streptomycin enthalten (Pen/Strepto). Plattieren Sie zusätzliche Vertiefungen von Zellen, um die Zellzahl pro Bedingung für die Normalisierungen in Schritt 1.12 zu quantifizieren. Inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2.
- Kultivieren Sie die Zellen 2-3 Tage lang, bis sie zusammenfließen.
- Bereiten Sie am Tag des Experiments die folgenden Lösungen vor: 1x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 und Krebs Ringers HEPES (KRH) Puffer, pH 8,0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mM D-Glucose). Auf 37 °C vorwärmen.
- Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 mL 1x PBS, pH 7,4,
Anmerkung: Dieses Protokoll eignet sich auch für die schnelle Teilung nicht-konfluenter Zellen. In diesem Fall ist es wichtig, die Radioaktivität entweder auf die absolute Zellzahl oder den DNA-Gehalt zu normalisieren. Erwägen Sie außerdem, die Größe der Kulturplatte oder des Kulturkolbens zu erhöhen, um die Gesamtzellzahl und die cpm-Werte zu erhöhen. Dies ist wichtig, um dies individuell empirisch zu ermitteln.
- Aspirieren Sie 1x PBS und waschen Sie die Zellen einmal mit 1 mL KRH.
- Stellen Sie 4 μCi/ml L-[3,4-3 H]-Glutamin-Arbeitsmedium her, indem Sie 4 μl [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-Glutamin-Brühe pro 1 ml KRH.
Anmerkung: Bevor Sie radioaktive Stoffe verwenden, wenden Sie sich bitte an das Amt für Strahlenschutz Ihrer Heimatinstitution, um Genehmigungen einzuholen. Alle Eingriffe im Zusammenhang mit der Strahlung müssen hinter der Plexiglasscheibe durchgeführt werden.
- Inkubieren Sie Zellen mit 0,5 mL KRH, die 4 μCi/mL L-[3,4-3 H]-Glutamin-Arbeitsmedium enthalten, für 5 min.
- Sammeln Sie das radioaktive Medium und geben Sie es in den Behälter für flüssige Abfälle. Waschen Sie die Zellen dreimal kurz mit eiskaltem KRH, um die Reaktion zu beenden. Sammeln und entsorgen Sie alle Wäschen im Behälter für radioaktive Flüssigkeiten.
- Geben Sie 1 ml 1 % SDS in jede Vertiefung und trituieren Sie 10x, um die Zellen zu lysieren und zu homogenisieren. Übertragen Sie die Zelllysate in 1,5-ml-Röhrchen. Entsorgen Sie Zellkulturplatten, serologische Pipetten und Pipettenspitzen im Behälter für feste radioaktive Abfälle.
- Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei >10.000 x g. Die Überstände werden in Szintillationsfläschchen mit 8 ml der Szintillationslösung überführt. Mischen Sie, indem Sie die Szintillationsfläschchen kräftig schütteln. Entsorgen Sie Röhrchen und Pipettenspitzen in einem Behälter für feste radioaktive Abfälle.
- Lesen Sie die Radioaktivität in Zählungen pro Minute (cpm) mit einem Szintillationszähler ab. Entsorgen Sie Szintillationsfläschchen in einem Abfallbehälter für Szintillationsfläschchen.
- Trypsinisieren, resuspendieren und zählen Sie die Zellen aus den verbleibenden nicht-radioaktiven Zellplatten (siehe Schritt 1.1), um die Anzahl der Zellen in den lysierten, radioaktiven Kulturen zu schätzen. Zählen Sie mit einem Hämozytometer die Anzahl der Zellen pro nicht-radioaktiver Vertiefung für jede Versuchsbedingung. Normalisieren Sie den cpm von Schritt 1.11 auf die geschätzte Zellzahl aus den nicht-radioaktiven Platten.
- Dekontaminieren Sie nach Abschluss des Experiments die Zellkulturhaube, den Tisch und alle Instrumente mit einem Radioaktivitäts-Dekontaminationsspray. Führen Sie abschließend Wischtests durch, um sicherzustellen, dass der Arbeitsbereich strahlungsfrei ist.
